張 玨， 沈 潔， 劉昱均， 夏詠梅

（1.江蘇省原子醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫214063；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的組成與結構

張 玨1，2， 沈 潔2， 劉昱均2， 夏詠梅2

（1.江蘇省原子醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫214063；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

從靈芝深層發(fā)酵液中獲得的靈芝胞外多糖，經硫酸化后其抑癌活性大幅提升。硫酸化后，靈芝胞外多糖的結構和構象都發(fā)生一定的變化。經單糖組成分析和光譜初步解析，硫酸化靈芝胞外多糖的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其摩爾比為9∶3∶2∶4∶48；其主鏈可能是以α-D-Gal（1→6）為主或混雜有α-D-Gal，Rha，α-D-Glc，α-D-Man以及Ara為側鏈，其硫酸基團可能接在C-3、C-4、C-6位上。硫酸化前靈芝多糖的構象主要為單螺旋結構，而修飾后呈三維螺旋結構，x-衍射亦證實其結構的有序變化。

靈芝；多糖；硫酸化；多糖硫酸酯；發(fā)酵

化學療法、輻射療法等在殺死腫瘤、癌細胞的同時，也帶來極大的毒副作用。而腫瘤免疫療法主要是通過刺激機體的免疫系統(tǒng)如淋巴系統(tǒng)等使機體免疫力得到恢復和提高，再由機體本身的抵抗力去殺死腫瘤細胞，毒副作用小。真菌多糖如靈芝多糖是一類免疫療法的保健品[1-8]，是毒副作用小、安全、療效高的抗腫瘤免疫調節(jié)劑，在腫瘤免疫治療方面有良好的應用前景，但往往活性不高。硫酸化修飾真菌多糖則是提升多糖抑癌作用的重要手段[2-9]。多糖抗腫瘤、提高機體免疫活性的功能與其分子組成、相對分子質量、溶解度、支化度、黏度等因素有關外，還與其立體構型密切相關；因此多糖經過硫酸化修飾后，其結構、相對分子質量、溶解度會有所變化，進而可能引起其生物活性的變化，甚至可以為多糖帶來新的活性和功能。前期實驗表明，從靈芝深層發(fā)酵液中獲得的靈芝胞外多糖，經硫酸化后其抑癌活性大幅提升[10]。目前對子實體多糖或其硫酸化衍生物的結構研究較多[11-17]，而子實體多糖本身因其產地不同而差異較大。發(fā)酵靈芝的胞內多糖與子實體多糖組成相對較為類似，但是其胞內外多糖的組成可控性遠遠超過子實體多糖，因而發(fā)酵靈芝多糖是定向生產靈芝多糖的有效途徑。其中，發(fā)酵靈芝的胞外多糖活性相對較低，更有必要通過硫酸化而改善其生物活性；但目前對硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖的結構組成還缺乏應有的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖（GLPs）：作者所在實驗室自制；化學試劑：均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；透析袋（截流相對分子質量3 500）：購自華美生物工程公司上海分公司。

1.2 儀器

紫外光譜儀：HitachiU-3000；紅外光譜儀：ThermoNicoletNexus；核磁共振儀：BrukerARX400；X-衍射儀：BrukerD8AXS。

1.3 方法

1.3.1 硫酸化發(fā)酵靈芝胞外多糖（GLPs）的制備作者所在研究室保藏的靈芝菌種，30℃下150 r/min液體深層二級培養(yǎng)11 d，即得靈芝發(fā)酵液。將靈芝發(fā)酵液離心后取其上清液，適當濃縮后在4℃下用4倍體積醇沉，經脫蛋白后凍干則得到發(fā)酵靈芝胞外粗多糖。所得多糖用氨基磺酸-吡啶混合試劑進行硫酸化，反應至取代度不再上升后停止反應，經碳酸氫鈉溶液中和、醇沉、乙醇洗滌和去離子水透析，凍干得到硫酸化靈芝胞外多糖。改變多糖與氨基磺酸的比例可以得到不同取代度的GLPs。然后，用DEAE纖維素柱（2.6 cm×30 cm）分離上述GLPs水溶液，以H2O和0.2、1.0、1.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫（洗脫速度48 mL/h，3 mL/管；上樣量為4 mL）。將上述收集到的多糖組分透析，4℃下先用蒸餾水透析48 h，再用超純水透析48 h，中途每8小時換水一次。然后減壓濃縮，再以SephadexG75凝膠柱（2.6 cm×100 cm）進行分離，以H2O進行洗脫（流速36 mL/h，5 mL/管；上樣量為10 mL）。最后凍干得到GLPs供分析用。

1.3.2 GLPs的單糖組分分析

1）多糖的水解：15 mg多糖溶液中加入2 mol/L的硫酸溶液2 mL，封管，120℃下水解5 h。用碳酸鈉中和水液，過濾，冷凍干燥。蒸干后的殘留物在60℃下真空干燥8 h，然后置干燥瓶中冷卻備用。

2）多糖的衍生化：10 mg多糖的水解物或標準單糖經干燥后，置于10 mL反應管中，加10 mg鹽酸羥胺和0.5 mg吡啶，在90℃水浴中反應30 min，取出冷卻至室溫，再加入0.5 mL醋酸酐，90℃水浴中繼續(xù)反應30 min。將反應液減壓蒸干，用0.5 mL重蒸氯仿提取，取氯仿層用于氣相色譜分析。

3）氣相色譜分析條件：Shimadzu，彈性石英毛細管柱 （0 V1701，30 m，I.D.0.32 mm，液膜厚度1.05 μm）；程序升溫，185℃保持3 min，3℃/min至240℃，維持25 min。汽化室溫度260℃，F(xiàn)ID檢測溫度260℃，載氣壓力（N2）0.6 MPa，氫氣0.65 MPa，空氣0.5 MPa，分流比30∶1。

4）相對分子質量測定：采用HPLC凝膠過濾法。Water 600 Controller，2410RefractiveIndex檢測器，WatersUltrahydrogelTMLinear7.8 mm×300 mm柱；流動相為0.1 mol/L NaNO3；流速0.9 mL/min，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 硫酸化靈芝胞外多糖的分離及其主要組分的相對分子質量

靈芝多糖經硫酸化修飾后分子中含陰離子基團，而未修飾的多糖分子仍呈電中性，經過DEAE-纖維素陰離子交換柱后，因彼此的電性不同而被先后洗脫下來，洗脫結果見圖1、表1。從圖1可知，隨著取代度的提高，水洗脫組分收率降低，鹽組分收率增加，尤其是1.0 mol/L NaCl洗脫組分的收率大大提高，因而使得硫酸化后靈芝多糖的相對分子質量分布變窄，見圖2。

圖1 硫酸化GLPs在DEAE上的洗脫曲線Fig.1 ElutioncurvesofsulfatedGLPsonDEAE-cellulosecolumneluted by H2O and saline

收集硫酸化靈芝胞外多糖1.0 mol/L NaCl洗脫組分，對其進行透析，濃縮。以SephadexG75凝膠柱對進行分離，水洗脫，隔管檢測，有兩個吸收峰，但以其中一個組分為主，收集其主要部分組分進行透析、濃縮、冷凍干燥以進行后續(xù)的結構分析。所得樣品經瓊脂糖電泳、HPLC分析見圖2。結果表明，其組成相對分布較窄。由于采用的是堿性瓊脂糖電泳系統(tǒng)和甲苯胺藍顯色劑，只有酸性多糖才能泳動和染色，由此可以說明，靈芝胞外多糖GLP已被硫酸酯化，HPLC凝膠過濾結果為單一峰。

采用凝膠排阻色譜法，以葡聚糖標準品作標準曲線（R2=0.999 2）。經測定發(fā)酵靈芝胞外多糖的相對分子質量為10 967，相對分子質量分布為16.56，GLPs的相對分子質量為18 944，相對分子質量分布為4.34。硫酸化后靈芝多糖的相對分子質量分布均變窄，發(fā)酵靈芝胞外多糖的相對分子質量也接近于子實體多糖[17]。

表1 硫酸化GLPs在DEAE上的分離結果Table 1 Separation results of sulfated GLPs on DEAE-cellulose

圖2 GLP（左條帶）與硫酸化GLPs（右條帶）瓊脂糖凝膠電泳圖譜及硫酸化GLPsHPLC圖Fig.2 Agaroseelectrophoresis of GLP（left lane）and sulfated GLPs（right lane）and HPLC profile of sulfated GLPs

2.2 硫酸化靈芝胞外多糖的結構分析

靈芝胞外多糖硫酸化后未出現(xiàn)新的紫外吸收（圖3a），而紅外光譜（圖3b）表明，GLPs除了多糖母體特征吸收峰得以保留外，還增加了1 266 cm-1左右S=O的伸縮振動峰；C—O—S的拉伸振動多在810～830 cm-1，多糖母體832.57 cm-1為α-型差向異構體的C—H平伏鍵吸收峰（是α-D-甘露吡喃糖、半乳吡喃糖或α-D-葡萄吡喃糖的特征吸收峰），因而GLPs在832.37 cm-1的吸收峰變寬，比多糖母體832.57 cm-1的吸收峰略向低波數(shù)移動。同時，在3 600～3 200 cm-1之間為一組較寬的糖O—H的伸縮振動特征吸收峰，GLP的峰值偏近3 412 cm-1，說明分子間氫鍵數(shù)量較分子內氫鍵數(shù)量占優(yōu)勢；而經過硫酸酯化修飾后，GLPs在此處的羥基伸縮振動吸收峰偏向高波數(shù)并且峰形變窄，這是因為酯化后，SO的引入使得分子內氫鍵數(shù)量增加而分子間氫鍵相應減少，所以硫酸化后多糖水溶性得到改善。此外，2 938.58 cm-1和2 929.77 cm-1的亞甲基C-H伸縮振動峰為糖單元C6的特征吸收峰，酯化后其吸收峰減弱；因為C6位上的羥基空間位阻較小，所以一般硫酸酯化容易在C6發(fā)生。

圖3 GLP與硫酸化GLPs紫外和紅外圖譜Fig.3 UV and IR Spectrum of GLP and sulfated GLPs

硫酸化靈芝胞外多糖GLPs的核磁共振碳譜見圖4。由于多步分離，GLPs多糖分子鏈組成比硫酸化前相對簡單。

糖鏈中未發(fā)生取代的C6通常位于δ60～64，若發(fā)生取代則通常移至 δ67～70；GLPs的13C譜在δ69.118左右出現(xiàn)信號，由此進一步推測硫酸基在C-6位發(fā)生了取代。通常糖鏈中未取代C-2、C-3和C-4的化學位移在δ70～77，取代后則共振位移至δ77～85。GLP在此區(qū)域無信號，說明糖鏈中可能以1-6鏈接為主；GLPs出現(xiàn)δ79.475的信號，因而在此三個位置中發(fā)生了硫酸基取代。由于在δ100區(qū)域，異頭碳為一組峰，因而我們推測在C-3、C-4的可能性比較大。

圖4 GLPs（a）與硫酸化GLP（b）核磁共振碳譜Fig.413C NMR spectrum of sulfated GLPs（a）and GLP（b）

2.3 硫酸化靈芝胞外多糖單糖組成

硫酸化靈芝胞外多糖GLPs水解成單糖后的氣相色譜見圖5。GLPs由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，糖組成比較簡單。經計算得出的單糖組成摩爾比為鼠李糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=9∶3∶2∶4∶48。

已有文獻報道的靈芝多糖的單糖組成以葡萄糖為主，半乳糖雖然也是發(fā)現(xiàn)的主要單糖組成之一，但其含量一般不高[13，18-20]。本研究的發(fā)酵靈芝胞外多糖組成中半乳糖近半，糖鏈組成以半乳糖為主，這種多糖組成與作者所在實驗室類似研究結果相近，且為作者所在實驗室首次發(fā)現(xiàn)和報道[21]。這可能是由于靈芝菌有著強大的酶系且酶活力強，可以對纖維、糖類、蛋白質等多種物質加以利用并產生豐富的次生代謝產物，因此發(fā)酵過程的細微差異，如靈芝菌株的不同、培養(yǎng)基基質的不同、發(fā)酵條件等諸多因素，都會引起多糖產物代謝的不同響應。目前，有關高等真菌多糖合成代謝方面的信息知之甚少，對靈芝多糖的生物合成途徑也是少有研究和報道，對于影響靈芝多糖種類和單糖構成的關鍵酶及這些多糖的單糖糖元的后期聚合途徑仍然不了解，這些都需要今后進一步深入研究，以對靈芝多糖定向發(fā)酵調控提供借鑒。

圖5 硫酸化GLP水解產物氣相色譜Fig.5 GC chromato graphy of hydrolyzed GLP sulfates

根據(jù)其單糖組成分析，結合紅外光譜分析中多糖母體有832.57 cm-1的吸收峰，此為α-型差向異構體的C-H取平伏鍵的吸收峰，是α-D-甘露吡喃糖、α-D-半乳吡喃糖或α-D-葡萄吡喃糖的特征吸收峰[17]，結合NMR譜的結果推測：靈芝多糖為雜多糖，其主鏈可能以α-D-Gal（1→6）為主或混雜有α-D-Gal，Rha，α-D-Glc，α-D-Man以及Ara為側鏈，其硫酸酯中硫酸基團可能接在C-6、C-3、C-4位上。

2.4 硫酸化靈芝胞外多糖的構象分析

靈芝多糖硫酸化前后與剛果紅形成的復合物在不同濃度的NaOH溶液中其最大吸收波長的變化見圖6，未修飾的GLP的構象為單螺旋結構[21]。

圖6 硫酸化前后GLP與剛果紅復合物λmax變化Fig.6 Changes in the absorption maximum （λmax）of the Congored-GLP/sulfated GLP complex

GLPs與剛果紅形成的復合物的最大吸收波長（λmax）在NaOH濃度為0.05～0.15 mol/L時，λmax有一穩(wěn)定區(qū)；當NaOH濃度大于0.25 mol/L后，λmax急劇下降到與GLP相同。以上結果表明，GLPs在中性至弱堿性范圍內是一有序的多股螺旋，在中等堿性條件下（0.15～0.3 mol/L NaOH溶液）發(fā)生構象轉變，在強堿性條件下則有序螺旋結構發(fā)生解體，x-衍射圖見圖7?？梢钥闯?，修飾前后靈芝胞外多糖的糖鏈分子由較為寬泛的松散無定形結構變?yōu)橐欢ǖ挠行蚪Y構。許多糖單位的羥基被—NH2、—SO3等基團后，糖環(huán)構象可能扭曲或轉變并利于形成非共價鍵，而且?guī)噪姾苫鶊F間的相互排斥作用導致卷曲構象呈伸展和剛性狀態(tài)[22-23]。當多糖環(huán)被硫酸基修飾，這些陰離子基團間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長；而且部分硫酸基可能會和糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，因而在糖鏈局部可能形成了螺旋結構，呈有活性的高級構象，且有序性增大。

圖7 GLPX-衍射圖Fig.7 X-ray diffraction of GLP and sulfated GLP

3 結語

目前多糖硫酸化修飾的研究多集中于子實體多糖[24]，對發(fā)酵（靈芝）多糖硫酸化的報道相對較少；硫酸酯化的方法的報道多集中在氯磺酸-吡啶法[25]和三氧化硫-吡啶法[26]。前者反應活性大但副反應多，后者反應較溫和，但試劑的價格過于昂貴；高取代度的硫酸酯化（靈芝）多糖獲取難度大，一般均低于1.5[27-28]，這也是有關硫酸化（靈芝）多糖的活性和取代度的對應關系報道仍然不多的原因之一；針對氨基磺酸為硫酸酯化試劑的多糖衍生化研究也不多見。作者對采用氨基磺酸法制備的不同取代度的硫酸化靈芝胞外多糖進行了分離純化，并對發(fā)酵靈芝胞外多糖經修飾后其結構組成、硫酸基團引入后的結構及構象變化進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，隨著多糖硫酸基取代度的提高，糖鏈分子電性增加，水洗脫的中性多糖回收率下降，鹽洗脫組分的收率上升，其中1.0 mol/L NaCl次脫組分的回收率提高顯著。紅外光譜中亞甲基（—CH2—）的C—H伸縮振動峰減弱，說明硫酸酯化可能在C6發(fā)生取代。硫酸化靈芝胞外多糖單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，比例為9∶3∶2∶4∶48；其主鏈可能是以α-D-Gal（1→6）為主或混雜有α-D-Gal，Rha，α-D-Glc，α-D-Man以及Ara為側鏈，其硫酸基團可能接在C-6、C-3、C-4位上。比旋光度、構象、X-衍射分析結果表明，經硫酸化后，靈芝胞外多糖的一級結構和高級結構都發(fā)生一定變化，修飾前其構象為單螺旋結構，修飾后呈三維螺旋結構，由此引起其抗腫瘤活性的增加[10]。

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Constituents and Structures of Sulfated Extracellular Polysaccharides from Ganoderma lucidum Fermentation Broth

ZHANG Jue1，2， SHEN Jie2， LIU Yujun2， XIA Yongmei2
（1.Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The sulfation of extracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum （GLP）from the submerged fermentation broth can dramatically enhance their antitumor activity.The structure and conformation of GLP might change due to the sulfation.The structure of the sulfated GLP was analysized with glycosyl residual composition analysis，IR，UV and NMR.The polysaccharide consists of rhamnose，arabinose，mannose，glucose and galactose with a molar ratio of 9∶3∶2∶4∶48.The main chain of the polysaccharide may consist of the unit of α-D-Glc（1→6）or the side chain is mixed of α-D-Glc，Rha，α-D-Man，and Ara.The sulfate groups may be connected to C-3，C-4，and C-6 of the sugar unit.Meanwhile，the sulfated polysaccharides present very different conformation comparing to the native polysaccharides.The sulfated polysaccharides possessed a triple helix whereas the native polysaccharide preferred the single helical，which was also confirmed by x-ray diffraction.

Ganoderm lucidum，polysaccharide，sulfation，polysaccharide sulfate，fermentation

O 657.3

A

1673—1689（2015）05—0547—07

2014-03-19

食品科學與技術國家重點實驗室自由探索基金資助項目（SKLF-ZZB-201504）。

張 玨（1969—），女，上海人，工學博士，副研究員，主要從事天然產物活性和免疫學方面的研究。E-mail：zhangjue@jsinm.org