田芳，張昊，莫燦龍，胡輝，譚文

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注模型的改進及評價

田芳，張昊，莫燦龍，胡輝，譚文

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

目的建立穩(wěn)定可靠、成功率高的大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)模型。方法25只SD大鼠隨機分為MCAO/R組(n＝15)和假手術(shù)組(n＝10)，采用改進的Longa線栓法制作大鼠MCAO/R模型；術(shù)后1、3、7 d評估大鼠神經(jīng)功能；術(shù)后7 d TTC染色計算腦梗死體積；HE染色檢查組織形態(tài)變化，NeuN免疫組織化學(xué)染色檢測神經(jīng)元存活狀況。結(jié)果模型成功率為86.7%；成功的模型動物均出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損；腦梗死體積為35.5%±1.2%(梗死體積/對側(cè)半球體積)；損傷側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯病理改變，神經(jīng)元大量死亡。結(jié)論改進法制備的大鼠MCAO/R模型成功率高、重復(fù)性及穩(wěn)定性好，可更好地應(yīng)用于腦缺血/再灌注損傷的相關(guān)研究。

大腦中動脈閉塞/再灌注；大鼠；動物模型；線栓

腦梗死是危害人類健康的主要疾病之一，該病大多發(fā)生于大腦中動脈(MCA)[1]。大鼠MCAO/R模型是研究腦梗死最常用的動物模型之一，通常通過線栓的插入和拔出造成MCA的栓塞及再灌注。線栓頭部大小和形狀對模型的成功至關(guān)重要。然而，常用的灼燒法制成的線栓造模成功率較低，且阻塞效果在不同體質(zhì)量大小的動物間差別較大，導(dǎo)致模型穩(wěn)定性較差，從而對腦缺血疾病的研究和藥物作用的評價造成了一定影響。本研究針對這一問題，采用硅膠包被技術(shù)對線栓頭端進行處理，并使動物體質(zhì)量與線栓頭端直徑相匹配，從而更成功、有效的阻斷流向MCA的血流，同時通過腦血流的實時監(jiān)測及建模后組織學(xué)等的評價驗證模型的成功及穩(wěn)定性，為相應(yīng)研究提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美國Sigma，批號:101315079)；鼠Anti-NeuN(美國Milipore，批號: MAB377)；二抗(丹麥DAKO，批號:K4001)；市售魚線(0.28 mm)；XT-X-4A手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江新天醫(yī)療器械有限公司)；PA15139動物脈搏血氧儀(美國MouseOx Plus Starr Life Sciences)；PF5001激光多普勒血流儀(瑞典Perimed AB)；RM2255旋轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica)；DM4000光學(xué)顯微鏡(德國Leica)。

1.2 實驗動物與分組

成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自中山大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵) 2011-0029。25只動物隨機分為2組:MCAO/R組(n＝15)和假手術(shù)組(n＝10)。

1.3 線栓制備

將直徑0.28 mm的魚線剪成3 cm長的線段，在其前段(5～6 mm)均勻包裹一薄層硅膠，涼干后在手術(shù)顯微鏡下選取硅膠包被均勻光滑、頭端圓鈍的線栓，游標卡尺測量其頭端直徑，挑出直徑0.36 mm及0.38 mm左右的線栓，在距離其前端2 cm處作標記。1.4 建立MCAO/R大鼠模型

1.4.1 術(shù)前準備 實驗前大鼠飼養(yǎng)在25℃室溫，12 h晝夜交替，自由攝食和飲水的環(huán)境里。術(shù)前禁食12 h，不禁水。

1.4.2 模型制作 5%(φ)異氟烷麻醉大鼠，用恒溫電熱毯使其體溫維持在(37.0±0.5)℃，改進Longa 法[2]制作MCAO/R模型。頸部正中切口，鈍性分離頸部肌肉，手術(shù)顯微鏡下暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。沿ICA繼續(xù)向顱底方向分離出翼腭動脈(PPA)并將其結(jié)扎。在CCA分叉下方剪一個小口，然后將硅膠包被的線栓通過這個小口插入(體質(zhì)量250～280 g大鼠使用頭端直徑0.36 mm線栓；體質(zhì)量280～300 g大鼠使用頭端直徑0.38 mm線栓)，繼續(xù)前進使線栓進入ICA直到其頭部到達MCA根部，這時可以感覺到輕微的阻力，從CCA分叉處算起，進入頸內(nèi)動脈的線栓長度約為18～22 mm，這樣便阻斷了流向MCA的血流。MCA閉塞2 h后再次麻醉大鼠，輕輕將線栓拔出使血流重新流入MCA。假手術(shù)組的手術(shù)操作步驟基本同MCAO/R組，但無線栓插入。

術(shù)中使用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流以判斷模型是否成功，在囟門后側(cè)2 mm，右側(cè)5 mm處[2]用多普勒探頭分別于MCA閉塞前、閉塞后及再灌注后測腦血流。閉塞后該處血流下降到閉塞前的30%以下則標志著缺血成功，這是造成神經(jīng)元損傷的前提[4]，再灌注后血流上升到閉塞前的70%以上則表明未發(fā)生顱底出血，再灌注成功[5]。術(shù)中同時使用動物脈搏血氧儀監(jiān)測大鼠心率、動脈血氧飽和度及呼吸頻率。術(shù)后給予動物充足食物和水。

1.5 神經(jīng)功能評估

單盲法分別于術(shù)后1、3、7 d對大鼠神經(jīng)功能缺損程度進行評估，方法參照Bederson等[6]的評分法并稍加改進:0分，無缺損，提尾懸空時兩前肢均可伸直。1分，輕度缺損，提尾懸空時左側(cè)前肢屈曲、肩內(nèi)收。2分，中度缺損，提尾懸空時左側(cè)前肢屈曲、肩內(nèi)收；置動物于軟塑料板上，施加側(cè)向推力，左側(cè)的側(cè)向推動阻力明顯降低，不向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分，中度到重度缺損，同2分評分中現(xiàn)象，并向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。4分:重度缺損，不能自發(fā)行走及意識水平下降。

1.6 梗死體積測定

術(shù)后7 d對大鼠實施安樂死(MCAO/R組n＝8，假手術(shù)組n＝6)，取腦組織將其冠狀切為6片，每片厚2 mm，然后將腦片置于2%TTC中，37℃ 孵育約10 min，最終正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈白色。染色后的腦片用10%(φ)甲醛溶液緩沖液固定，掃描儀進行正反兩面掃描。ImageJ 1.48 u軟件測定損傷側(cè)非梗死區(qū)面積和對側(cè)半球面積，兩者之差即為梗死面積，利用面積乘以切片厚度可分別求得梗死體積與對側(cè)半球體積，最終結(jié)果用同側(cè)腦梗死體積占對側(cè)腦半球體積的百分比表示[7]。

1.7 組織切片制作

術(shù)后7 d將大鼠深度麻醉(MCAO/R組n＝5，假手術(shù)組n＝4)，4%(φ)多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌流后取腦，然后將腦組織置于10%甲醛溶液中固定至少48 h，選取前囟點前、后各1 mm之間的腦組織塊，脫水并包埋到蠟塊中。用旋轉(zhuǎn)式切片機將組織塊冠狀切為5 μm厚的切片，并展平到載玻片上用于后續(xù)染色。

1.8 組織學(xué)檢查

將“1.7”中制好的組織切片進行常規(guī)HE染色，并在顯微鏡下觀察兩組切片的組織形態(tài)學(xué)。

1.9 神經(jīng)元存活狀況檢測

以anti-NeuN作為一抗，將“1.7”中制好的組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，檢測兩組動物腦組織中的神經(jīng)元存活狀況。步驟如下:檸檬酸鹽緩沖液煮沸10 min，3%H2O2處理10 min，5%BSA室溫封閉30 min，anti-NeuN(1∶2 000)4℃孵育過夜，二抗37℃孵育40 min，DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染5 s，封片后顯微鏡下觀察兩組切片的NeuN免疫陽性細胞。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腦血流變化

MCAO/R組采用頭端直徑0.36 mm及0.38 mm的線栓閉塞MCA后均使腦血流下降到了閉塞前的30%以下，再灌注后又上升到了閉塞前的70%以上，表明模型構(gòu)建成功。此外，兩種不同規(guī)格的線栓與大鼠體質(zhì)量匹配后造成的腦血流變化一致(表1)。

表1MAO/R組不同直徑線栓造成的腦血流變化Table 1Changes of cerebral blood flow caused by different suture diameters in MCAO/R group

2.2 生理參數(shù)

如表2所示，所有動物的生理參數(shù)均正常、一致，MCAO/R組與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 模型成功率及死亡率

本實驗 MCAO/R組15只大鼠中，成功構(gòu)建MCAO/R模型13只，模型成功率為86.7%。其中2只于術(shù)后1 d死亡，開顱取腦未發(fā)現(xiàn)顱底出血現(xiàn)象，但腦組織出現(xiàn)較嚴重水腫，死亡率為13.3%。

表2兩組實驗動物的生理參數(shù)Table 2Physiological parameters in two groups(±s)

表2兩組實驗動物的生理參數(shù)Table 2Physiological parameters in two groups(±s)

組別 心率/(次·min－1)呼吸頻率/(次·min－1)血氧飽和度/%體溫/ ℃MCAO/R組MCA閉塞前 342.1±12.8 61.0±2.7 99.3±0.1 36.8±0.1 MCA閉塞后 345.4±11.9 61.5±3.2 99.1±0.1 36.6±0.1 MCA再灌注后 350.6±8.7 61.5±3.5 98.4±0.2 36.4±0.1假手術(shù)組手術(shù)前 347.7±12.2 64.4±3.3 98.6±0.5 36.7±0.1手術(shù)后 348.2±11.1 62.8±3.0 98.5±0.3 36.5±0.2手術(shù)后2 h 350.8±9.8 62.9±2.8 98.6±0.3 36.6±0.2

2.4 神經(jīng)功能缺損評分

術(shù)后1、3、7 d，假手術(shù)組動物未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，各時間點Bederson評分均為0分。而MCAO/R組動物出現(xiàn)了明顯神經(jīng)功能缺損，各時間點Bederson評分依次為3.2±0.1、2.9±0.2、2.5±0.2。MCAO/R組與假手術(shù)組相比在每個時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

圖1 術(shù)后1，3，7 d神經(jīng)功能缺損評分Figure 1 Neurological scores at 1，3 and 7 days after surgery

2.5 梗死體積

TTC染色結(jié)果顯示(圖2)，術(shù)后7 d假手術(shù)組腦組織無損傷表現(xiàn)，MCAO/R組腦組織梗死體積為(35.5%±1.2)%(梗死體積/對側(cè)半球體積)。

2.6 組織學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組和MCAO/R組正常側(cè)腦組織細胞間質(zhì)均勻無異常(圖3-A1)，高倍鏡下可見細胞形態(tài)清晰，神經(jīng)元胞體豐滿，未見異常病理變化(圖3-B1)。MCAO/R組損傷側(cè)皮層及基底節(jié)出現(xiàn)細胞間質(zhì)疏松現(xiàn)象(圖3-A2)，高倍鏡下可見腦組織損傷區(qū)(方框內(nèi)區(qū)域)出現(xiàn)細胞皺縮、核固縮、胞核深染或消失、炎細胞浸潤現(xiàn)象(圖3-B2)。

圖2 術(shù)后7 d各組腦組織TTC染色Figure 2 TTC staining of brain tissues in different groups at 7 days after surgery

圖3 術(shù)后7 d各組腦組織HE染色Figure 3 HE staining of brain tissues in different groups at 7 days after surgery

2.7 神經(jīng)元存活狀況

NeuN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織中可見大量NeuN免疫陽性細胞，而MCAO/R組腦組織損傷區(qū)NeuN免疫陽性明顯減弱，神經(jīng)元大量死亡(圖4，位置選取同HE染色)。

圖4 術(shù)后7 d各組腦組織NeuN免疫組織化學(xué)染色Figure 4 NeuN immunohistochemical staining of brain tissues in different groups at 7 days after surgery

3 討論

近年來人們?yōu)檠芯咳祟惸X梗死構(gòu)建了多種動物模型，其中線栓法制作的大鼠MCAO/R模型具有不開顱、手術(shù)操作簡便、創(chuàng)傷小、可以控制缺血及再灌注時間等優(yōu)點，能夠最大程度模擬人類腦梗死后的病理生理狀態(tài)[8]，為該病的發(fā)病機理研究及藥物療效評估提供了重要基礎(chǔ)。

線栓是MCAO/R模型成功的關(guān)鍵因素之一，線栓制作的關(guān)鍵是對其頭端的處理。線栓法的倡導(dǎo)者Longa采用的線栓制作方法比較簡單，就在其前端加熱灼燒形成一光滑而膨大的球形。Laing等[9]認為，Longa的線栓不易推進，且不易堵塞后交通動脈和穿支血管的血供，使得模型成功率和穩(wěn)定性難以保證。本實驗采用頭端前段包被硅膠的線栓，這種栓線較頭端教燒成光滑圓球的線栓柔軟度好，表面光滑，在線栓插入過程中對血管壁損傷小。更因前段5～6 mm范圍內(nèi)有硅膠包被，因此更易阻斷MCA血供，栓塞成功率高，重復(fù)性好，使得本實驗的模型成功率大大提高。

此外，本課題組也曾使用了灼燒法制作的頭端膨大的線栓，發(fā)現(xiàn)這種線栓在不同體質(zhì)量大小的動物間對腦血流的阻塞效果不同，導(dǎo)致腦梗死體積變異性較大，因此，除線栓頭端包被硅膠外，還應(yīng)考慮動物體質(zhì)量與線栓頭端直徑的匹配。Neil等[10]認為，在成年SD大鼠中，頭端直徑0.38 mm的線栓能夠造成恒定大小的腦梗死體積，但在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠體質(zhì)量較小時，0.38 mm的線栓會出現(xiàn)難以入顱或入顱后造成顱底出血的現(xiàn)象，因此本實驗就Neil的方法作了進一步改進:250～280 g大鼠使用頭端直徑0.36 mm的線栓，280～300 g大鼠使用頭端直徑0.38 mm的線栓。結(jié)果顯示，動物體質(zhì)量與線栓頭端直徑相匹配后，兩種不同規(guī)格的線栓均可順利入顱并造成恒定的腦血流下降，且未發(fā)生顱底出血現(xiàn)象，最終MCAO/R組出現(xiàn)明顯且恒定的腦梗死。這一改進方法更加有效地阻斷了MCA的血供，進一步降低了動物死亡率，提高了模型成功率及穩(wěn)定性。

在模型制作過程方面，與Longa法不同的是，本實驗的線栓是從頸總動脈插入，手術(shù)難度比從頸外動脈插入要小，更易操作，且不刺激氣管，對生理結(jié)構(gòu)的損傷小。更重要的是，在手術(shù)過程中使用激光多普勒血流儀實時、無創(chuàng)的監(jiān)測局部腦血流變化，保證了模型的穩(wěn)定可靠性。同時在手術(shù)顯微鏡下實施操作，較國內(nèi)流行的目視法，大大提高模型制作效率與成功率，成功制作1只動物模型僅需10～15 min。手術(shù)過程中，實時檢測和調(diào)控動物各項生理參數(shù)，保證了動物體溫、心率、呼吸頻率、血氧飽和度等生理指標的一致性，從而最大限度的排除了除手術(shù)之外其他因素對動物造成的影響。

本實驗選擇為期7 d的觀察，旨在進一步確定模型的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第7天時大鼠仍表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損，梗死灶及病理學(xué)變化也很明顯，因此這一模型也有助于觀察藥物長期療效。

通過對動物神經(jīng)功能缺損程度、腦梗死體積、組織形態(tài)變化、神經(jīng)元存活狀況等指標的綜合評價，本實驗采用改進法制作的MCAO/R模型成功率高、重復(fù)性及穩(wěn)定性好，較好地模擬了人類大腦中動脈缺血溶栓后的病理生理狀態(tài)，在此模型基礎(chǔ)上可從組織、細胞、分子等水平進行多種指標的檢測，從而展開對腦梗死病理生理機制的深入研究及藥物療效的評價。

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(責(zé)任編輯:王昌棟)

An improved method for inducing middle cerebral artery occlusion/reperfusion in rats

TIAN Fang，ZHANG Hao，MO Canlong，HU Hui，TAN Wen
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo establish a stable and reliable model of middle cerebral artery occlusion/ reperfusion(MCAO/R)in rats.MethodsTwenty-five male SD rats were randomly divided into the MCAO/R group(n＝15)and the sham-operated group(n＝10).The MCAO/R model was established by the modified suture-occluded method of Longa.The neurological deficits were evaluated at 1，3 and 7 days after the surgery.Then the brains were harvested to evaluate the infarct volume by TTC staining，the histomorphological changes by HE staining and the surviving neurons by NeuN immunohistochemical staining.ResultsThe success rate of MCAO/R model was 86.7%.All the model animals showed obvious neurological dysfunction after surgery.The volume of infarction/contralateral hemisphere was(35.5± 1.2)%.Histopathological changes and neuronal deaths occurred obviously in the ipsilateral hemisphere.ConclusionThe MCAO/R model established by the modified method is repeatable and stable with higher success rate，and suitable for study of cerebral ischemia/reperfusion injury.

MCAO/R；rats；animal model；suture

R－331

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.024

1006-8783(2015)05-0665-05

2015-05-21

廣東省科技計劃項目(2012B011000050)；廣州市重大專項科技項目(201300000051)

田芳(1989—)，女，2012級碩士研究生，Email:tf623731605＠163.com；通信作者:譚文，男，教授，主要從事醫(yī)藥生物學(xué)研究，Email:went＠scut.edu.cn。

時間:2015-09-12 14:47

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150912.1447.004.html