黃禮杰，陳潔娣，唐羽欣，劉青，孫曉鷗，譚文

(華南理工大學生物科學與工程學院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

主動脈弓縮窄誘發(fā)左心疾病相關的大鼠肺動脈高壓制備方法

黃禮杰，陳潔娣，唐羽欣，劉青，孫曉鷗，譚文

(華南理工大學生物科學與工程學院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州510006)

目的探討簡單有效的左心疾病相關肺動脈高壓(PH-LHD)大鼠模型的制備方法。方法雄性成年Wistar大鼠進行主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)手術，9周后檢測大鼠左心室舒張末壓、股動脈壓、心輸出量，并通過組織HE染色觀察肺動脈血管的重構，通過免疫熒光染色觀察肺間質Ⅰ型膠原的變化。結果主動脈弓縮窄9周后，大鼠的左心室舒張末壓顯著增加，心輸出量、心率均顯著降低，肺血管發(fā)生顯著重構，管腔面積減小，同時肺間質Ⅰ型膠原顯著增加。結論通過主動脈弓縮窄術成功制作了大鼠PH-LHD模型。

肺動脈高壓；大鼠；主動脈弓縮窄；左心室舒張末壓

左心疾病相關肺動脈高壓是臨床上的一類重要肺動脈高壓疾病，屬于第2類肺動脈高壓。60%～80%的充血性心力衰竭患者伴有肺動脈高壓，左心疾病是肺動脈高壓最常見的誘因[1]。目前，國外雖有報道主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)術制備肺動脈高壓小鼠模型[2]，但尚無文獻報道利用TAC術制備左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型。本研究采用TAC術制備左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型，并主要通過對左心室舒張末壓的測量和肺血管重構的觀察來評價模型是否成功。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質量180～220 g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產許可證號: SCXK(粵)2013-0034。

1.2 主要藥品與試劑

戊巴比妥鈉(齊云生物公司，批號:201202)；肝素鈉(阿拉丁試劑公司，批號:k1207040)；蘇木素(MERCK公司，批號:2013032001)；伊紅(MERCK公司，批號:2013042701)；PBS磷酸鹽緩沖劑(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號: 43P00150)；檸檬酸抗原修復緩沖劑(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號:43K00120)。

1.3 主要儀器

P23516 Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞埃德儀器有限公司)；PL3516B49壓力-容積測定系統(tǒng)(澳大利亞埃德儀器有限公司)；SPR-383Millar導管(美國MILLAR公司)；Model3000小動物呼吸機(美國MIDMRK集團KENT公司)；TP1020組織脫水機、EG1150H石蠟包埋機、DM4000正置顯微鏡、RM2255旋轉切片機、ST5020多動能染色機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 將12只大鼠隨機分為兩組:假手術組(Sham組)、模型組(TAC組)，每組各6只。術后9周進行血流動力學評價。

1.4 造模方法

大鼠稱質量，腹腔注射3%(φ)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)。麻醉后，置于手術臺上(恒溫墊控溫37℃)，固定大鼠于仰臥位，氣管插管，設置呼吸機呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶1，潮氣量為4～6 mL/200 g。手術區(qū)域備皮碘伏消毒。從左胸部位斜向剪開皮膚，鈍性分離兩側皮膚，暴露更多的肌肉。鈍性分離出胸大肌和胸小肌。用眼科彎鑷在第二和第三根肋骨間開胸，并小心撥開左右兩片胸腺，暴露搏動的主動脈弓。在右無名動脈和左頸總動脈之間套進一根4-0的醫(yī)用真絲編織線，把21G針頭(外徑為0.8 mm)沿主動脈自然生長的方向放置(見圖1A)，結扎牢固后，抽出針頭(見圖1B)。繼續(xù)通氣15 min。待大鼠恢復自主呼吸后，解除呼吸機供氣，放回籠子飼養(yǎng)。Sham組，除了不結扎主動脈弓外，其他步驟與TAC組相同。手術后喂養(yǎng)標準顆粒的飼料及飲用水。

圖1 TAC造模結扎示意圖Figure 1 Ligation diagram in TAC model

1.5 動物模型評價

1.5.1 血流動力學評價 大鼠造模9周后，進行血流動力學評價。根據(jù)體重，經腹腔注射3%的戊巴比妥鈉進行麻醉。麻醉成功后，固定，通呼吸機，具體步驟參考模型制備。手術區(qū)域備皮消毒。行頸部正中切口，鈍性分離皮下組織及頸前正中肌肉，在呈“T”型的三塊肌肉下找到右頸總動脈，用玻璃分針小心分離右頸總動脈伴行的迷走神經。在右頸總動脈下穿線，結扎右頸總動脈的遠心端，在近心端置小動脈夾，穿線備用。用眼科剪在右頸總動脈近心端結扎處朝向心端方向呈45°角剪開“V”型小口，插入Millar導管后，于近心端處扎一個松結，松開動脈夾后，往心臟方向緩緩遞入Millar導管，遇到阻力時可適當回退，再繼續(xù)前進，直至電腦屏幕上呈現(xiàn)出正常穩(wěn)定的壓力-容積環(huán)即停止Millar導管遞送。為避免Millar導管脫落，扎緊近心端的松結，監(jiān)測左心室收舒張末壓、心率及心輸出量。

使用血壓計給予壓力傳感器0 mmHg和100 mmHg的壓力，使用兩點定標法定標。對大鼠左下肢腹股溝進行備皮消毒，分離股動脈，結扎遠心端，于近心端穿線備用，并動脈夾夾閉近心端，在近心端結扎處朝向心端方向呈45°角剪一“V”型小口，立即插入充滿含1%肝素的生理鹽水的PE10導管。待松開動脈夾后，繼續(xù)往向心端插入，扎緊導管。

1.5.2 組織病理學評價 血流動力學監(jiān)測完畢后，開胸檢測造模時所用線栓是否完整，若線栓斷裂或脫落，則視為造模失敗，該只大鼠不再進行后續(xù)實驗；若線栓完好，用手術剪將肺組織和心臟取下，用PBS洗2次后，吸盡表面液體，稱質量。從氣管插入軟管，對肺組織進行10%(φ)甲醛溶液灌流固定。灌流3～5 min后，待肺組織完全撐開，用細線系緊氣管，置于已經裝有10%甲醛溶液的病理袋中，并在肺組織表面放2小塊紗布，防止肺組織浮出液面。肺組織標本固定48 h后，取肺組織左肺葉，切去中間約1 cm寬度肺組織，組織脫水后石蠟包埋。

每組隨機取3只大鼠肺組織，切成5 μm厚的切片，封固于黏附型載玻片上。將石蠟切片60℃烤箱內烘烤1.5 h，按設定程序進行HE染色。

對已經HE染色的石蠟切片進行觀察并掃描肺動脈血管圖片。使用Image-Pro plus 6.0軟件對所拍肺動脈血管圖片進行盲法分析。將肺動脈血管按照直徑分為2類:小型血管(直徑為20～100 μm)，大型血管(直徑為100～500 μm)[6]。對所有肺動脈血管進行血管中層厚度測定。

1.5.3 免疫熒光觀察 取已經切好的石蠟切片，60℃烘箱中烤片脫蠟90 min后，立即置于多功能染色機中，進行脫蠟。脫蠟完畢后，用PBS洗3次，每次5 min。然后，置于95℃的檸檬酸中10 min，進行抗原修復。抗原修復完后，切片在檸檬酸中冷卻至室溫。再用PBS洗3次，每次5 min。然后，室溫下，用0.5%Triton X-100進行通透處理20 min。再用PBS洗3次，每次5 min。然后，用5%BSA在室溫下封閉20～30 min。滴加一抗(1∶500)，4℃孵育過夜。第2天，用PBS洗3次，每次5 min。再滴加二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h。用PBS洗4次，每次5 min。滴加DAPI染色7 min，用PBS洗3次，每次5 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5.4 統(tǒng)計分析 左心舒張末壓、平均股動脈壓、心率、心輸出量均由PowerLab軟件獲得。結果用±s表示，用Graphpad prism 5行統(tǒng)計分析。用t檢驗比較不同組間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學參數(shù)

與Sham組相比，TAC組左心舒張末壓顯著升高，心率、心輸出量顯著降低(表1)。

表1Sham組和TAC組大鼠血流動力學參數(shù)對比Table 1Comparison of hemodynamic parameters in sham and TAC rats(±s，n＝6)

表1Sham組和TAC組大鼠血流動力學參數(shù)對比Table 1Comparison of hemodynamic parameters in sham and TAC rats(±s，n＝6)

與Sham組比較:?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 左心舒張末壓/mmHg 平均股動脈壓/mmHg 心率/(次·min－1) 心輸出量/(mL·min－1) Sham組 2.563±1.024 130.052±7.589 448.0±10.8 56.93±2.90 TAC組 21.653±2.042??111.812±5.699 390.1±15.9?40.84±3.40??

2.2 血管重構

與Sham組相比，TAC組肺動脈血管中層增厚，血管發(fā)生嚴重肌化現(xiàn)象，且管腔面積減小(圖2)。

對于血管直徑＜100 μm的血管，與Sham組相比，TAC組大鼠中層厚度顯著增加(P＜0.01)(圖3)；對于血管直徑＞100 μm的血管，與Sham組相比，TAC組大鼠中層厚度顯著增加(P＜0.05)(圖4)。

圖2 Sham組和TAC組肺動脈血管重構比較(400×)Figure 2 Comparison of vascular remodeling in sham and TAC rats(400×)

2.3 肺間質Ⅰ型膠原變化

通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)TAC組大鼠肺間質Ⅰ型膠原顯著增加(圖5)，提示肺間質發(fā)生纖維化。

圖3 小型血管(直徑為20～100 μm)肺動脈血管中層增厚程度(n＝3)Figure 3 Medial thickness in small vessels(n＝3)

圖4 大型血管(直徑為100～500 μm)肺動脈血管中層增厚程度(n＝3)Figure 4 Medial thickness in large vessels(n＝3)

圖5 Sham組與TAC組肺間質Ⅰ型膠原比較(630×)Figure 5 Comparison of pulmonary interstitial collagenⅠin sham and TAC rats(630×)

3 討論

目前，左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型主要是通過升主動脈縮窄獲得，并通過測量右心室壓或肺動脈壓來驗證模型的成功[3-4]。然而，一方面，相比于TAC術，升主動脈縮窄術造模大鼠易發(fā)急性左心衰竭，成活率較低[5]。另一方面，測量右心室壓或肺動脈壓需要將米勒導管經過上腔靜脈、右心房，到達右心室，或繼續(xù)突破肺動脈瓣進入肺動脈。在插管過程中，導管很容易插入下腔靜脈，也很難通過三尖瓣進入右心室，經常導致導管到位失敗[6]。

國外有報道采用TAC術制備左心室相關肺動脈高壓小鼠模型，但尚無采用大鼠制備該種疾病模型的文獻報道。本研究采用TAC術制備左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型。在右無名動脈和左頸動脈之間結扎，具有較好的辨識性對大鼠傷害較小[7]。另外，本研究將左心室舒張末壓作為評價模型成功的主要指標，從右頸總動脈插管后經升主動脈進入左心室，測量左心室舒張末壓，操作簡單方便，較好地避免了上述右心室壓測量過程中存在的問題。

在肺循環(huán)中，來源于上下腔靜脈的靜脈血經過右心房到達右心室，被右心室泵出進入肺動脈，再進入各級分支肺動脈，進入肺泡周圍毛細血管網，進行氣體交換。靜脈血變成動脈血，再經肺內各級肺靜脈屬支進入肺靜脈，再進入左心房，左心室。然后被左心室泵出進入全身體循環(huán)(見圖6)。由于左心房的壓力與左心室的壓力基本一致，主動脈弓結扎后(見圖6)，左心室舒張末壓壓力升高，左心房的壓力隨之升高(即肺動脈楔壓升高)，導致壓力反向傳導，使肺動脈壓被動升高[8]。因此，左心室舒張末壓的升高可以推導出肺動脈壓升高[2]。

圖6 肺循環(huán)及主動脈弓結扎示意圖Figure 6 Diagram of pulmonary circulation

本研究以左心室舒張末壓大于20 mmHg作為評判大鼠肺動脈高壓模型成功的標準。TAC術9周后，TAC組6只大鼠只有1只左心室舒張壓小于20 mmHg，且TAC組大鼠左心室舒張末壓相比于假手術組有極顯著升高，說明TAC手術9周后成功建立大鼠肺動脈高壓模型。

肺動脈高壓過程中，肺動脈血管內皮功能紊亂，導致血管中層平滑肌細胞過度增殖，以至于血管中層增厚，甚至血管肌化，進而使血管阻力增加，肺動脈高壓進一步惡化[9-10]。

本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)，TAC組大鼠直徑為20～100 μm的肺細動脈中層顯著增厚，直徑為100 ～500 μm的肺阻力血管肺肌性動脈中層也顯著增厚且肌化嚴重，血管管腔面積減小。免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)，TAC組大鼠肺間質Ⅰ型膠原增加，提示肺部出現(xiàn)纖維化，肺彈性減弱。這些肺組織病理表現(xiàn)與TAC誘發(fā)肺動脈高壓小鼠模型的病理特征一致[2]，進一步驗證了該左心疾病相關肺動脈高壓大鼠模型符合要求。

綜上所述，本研究通過TAC手術成功制備了左心疾病相關肺動脈高壓的大鼠模型。

[1]YIN J，KUKUCKA M，HOFFMANN J，et al.Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure [J].Circ Heart Fail，2011，4(2):198-206.

[2]CHEN Y，GUO H，XU D，et al.Left ventricular failure produces profound lung remodeling and pulmonary hypertension in mice:heart failure causes severe lung disease[J].Hypertension，2012，59(6):1170-1178.

[3]YIN N，KAESTLE S，YIN J，et al.Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease[J].Crit Care Med，2009，37(3):980-986.

[4]HENTSCHEL T，YIN N，RIAD A，et al.Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure[J].Anesthesiology，2007，106(1):124-131.

[5]李曉梅，馬依彤，楊毅寧，等.小鼠主動脈弓縮窄模型的建立及評價[J].中國比較醫(yī)學雜志，2008，18(11):24-29，插2.

[6]張蕙.左心疾病所致的肺動脈高壓中肥大細胞聚集和肺血管重構的時間相關性[D].福州:福建醫(yī)科大學，2013.

[7]周亞光，屠恩遠，王照華，等.大鼠胸主動脈縮窄誘導心肌肥厚模型的建立[J].中國比較醫(yī)學雜志，2008，18 (12):21-24.

[8]MONTANI D，GUNTHER S，DORFMULLER P，et al. Pulmonary arterial hypertension[J].Orphanet J Rare Dis，2013(8):97.

[9]CROSSWHITE PATRICK，SUN Zhongjie.Molecular mechanisms of pulmonary arterial remodeling[J].Mol Med，2014(20):191-201.

[10]ADIR Y，AMIR O.Pulmonary hypertension associated with left heart disease[J].Semin Respir Crit Care Med，2013，34:665-860.

(責任編輯:王昌棟)

A method of establishing pulmonary arterial hypertension by transverse aortic
constriction in rats

HUANG Lijie，CHEN Jiedi，TANG Yuxin，LIU Qing，SUN Xiaoou，TAN Wen
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo explore a simple and effective model of pulmonary arterial hypertension due to left heart disease(PH-LHD)in rats.MethodsAdult male Wistar rats were performed by transverse aortic constriction surgery.After 9 weeks，left ventricular end diastolic pressure，femoral artery pressure，cardiac output and heart rate were chronologically collected.The pulmonary artery vascular remodeling was observed by hematoxylin-eosin staining.The pulmonary interstitialcollagenⅠ wasobserved by immunofluorescent staining.ResultsCompared with the sham group，the left ventricular end diastolic pressure was obviously increased，but the cardiac output and heart rate were significantly decreased in the model group.The vascular remodeling and reduced pulmonary artery lumen size were observed in the model group.Pulmonary interstitial collagenⅠwas increased in the model group.ConclusionA stable PH-LHD rat model could be successfully established by transverse aortic constriction in this research.

pulmonary arterial hypertension；rat；transverse aortic constriction；left ventricular end diastolic pressure

R－331

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.023

1006-8783(2015)05-0661-05

2015-05-21

廣東省重大科技專項(2012A080204001)；廣州市重大專項科技項目(201300000051)

黃禮杰(1987—)，男，2012級碩士研究生，Email:huanglijiew＠163.com；通信作者:譚文，男，教授，主要從事醫(yī)藥生物學研究，Email:went＠scut.edu.cn。

時間:2015-09-17 11:49

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150917.1149.002.html