操思凡，吳敏敏，蔣立艷

運動干預(yù)對大鼠多囊卵巢綜合征發(fā)生的影響

操思凡1，吳敏敏1，蔣立艷2，3

(廣東藥學(xué)院1.公共衛(wèi)生學(xué)院；2.臨床醫(yī)學(xué)院；3.附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510000)

目的研究運動干預(yù)對大鼠多囊卵巢綜合征(PCOS)發(fā)生的影響，評估暴露早期的運動干預(yù)對預(yù)防PCOS的作用。方法30只6周齡SD雌性大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。對照組灌服溶劑自然生長，模型組和預(yù)防組采用來曲唑法造模。預(yù)防組從造模開始同時接受運動干預(yù)。放射免疫法測大鼠血清性激素、空腹胰島素、瘦素，全自動生化儀測血脂、空腹血糖，HE染色觀察卵巢組織學(xué)變化。結(jié)果與對照組相比，模型組大鼠肥胖，動情周期紊亂，卵巢內(nèi)出現(xiàn)大量囊狀卵泡；血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)、空腹胰島素(FINS)、瘦素(Leptin)水平升高(P＜0.05)，孕酮(P)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)水平下降(P＜0.05)。預(yù)防組大鼠體質(zhì)量和動情周期正常，卵巢內(nèi)可見各級正常卵泡；T、LH、FINS、Leptin濃度較模型組降低(P＜0.05)，F(xiàn)SH、E2濃度升高(P＜0.05)；P濃度較模型組升高(P＜0.05)；高密度脂蛋白(HDL)水平顯著升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論早期適量的運動干預(yù)可以降低多囊卵巢綜合征模型大鼠雄激素水平，減輕胰島素抵抗，促進(jìn)排卵，阻止PCOS發(fā)生；同時具有保護(hù)心血管的功能，是預(yù)防PCOS的有效措施。

多囊卵巢綜合征；大鼠模型；運動干預(yù)；預(yù)防

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種育齡婦女常見的生殖、內(nèi)分泌與代謝紊亂綜合征，主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、不孕、多毛、胰島素抵抗、高雄激素血癥和血脂異常[1]?；颊呦虑鹉X-垂體-卵巢軸功能異常，存在心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和子宮內(nèi)膜癌高發(fā)的遠(yuǎn)期危險[2-4]。PCOS的病因仍不確切，研究表明其可能由某些遺傳因素與環(huán)境因素共同作用引起。目前PCOS尚無有效藥物治療，生活方式調(diào)整(lifestyle modification，LSM)是其治療首選[5]，包括合理飲食和運動。研究表明運動能有效緩解PCOS癥狀，改善妊娠結(jié)局[6-7]。但是，在疾病尚未發(fā)生時針對危險因素采取“一級預(yù)防”，才是預(yù)防和消滅疾病的根本措施[8]，而PCOS領(lǐng)域至今未見此類研究報道。因此，本研究以疾病預(yù)防為目的，探討運動能否作為PCOS的一級預(yù)防措施。由于人群干預(yù)試驗受到倫理學(xué)和可行性的限制[9-10]，本實驗采用動物實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級SD雌性大鼠，體質(zhì)量166.5～192.5 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2013-0002。

1.2 主要試劑

來曲唑片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字 H19991001)；羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC，美國Sigma公司)；生化檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)；放射免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.3 動物模型的構(gòu)建

將30只6周齡雌性SD大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只，分別為對照組、PCOS模型組和預(yù)防組，3組大鼠初始體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。使用來曲唑法誘導(dǎo)PCOS大鼠模型[11]:將來曲唑溶于1%(ρ)羧甲基纖維素(CMC)中，對模型組大鼠進(jìn)行1 mg/(kg·d)來曲唑連續(xù)灌胃21 d；預(yù)防組大鼠同樣進(jìn)行1 mg/(kg·d)來曲唑連續(xù)灌胃21 d，模擬PCOS暴露，同時每日進(jìn)行運動干預(yù)；對照組大鼠連續(xù)21 d等量CMC灌胃。每日定時稱大鼠質(zhì)量和陰道涂片。

1.4 陰道涂片

每日上午9時，用棉簽蘸取少量生理鹽水，插入大鼠陰道旋轉(zhuǎn)一圈，涂抹于干凈載玻片。瑞氏-吉姆薩染色后，蒸餾水沖洗，置于鏡下觀察。

1.5 運動干預(yù)

采用 Masashi的游泳法[12]:將大鼠置于水深50 cm，水溫35℃的桶中進(jìn)行無負(fù)荷自由游泳運動，每周運動6 d，每天運動120 min。每次運動時將鼠籠置于大鼠游泳的水桶旁，摒除環(huán)境的影響。

1.6 實驗取材及指標(biāo)檢測

末次灌胃后予以各組大鼠自由飲水并禁食12 h，3%(φ)戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定于自制的手術(shù)臺上，打開腹腔與胸腔，心臟取血5 mL并迅速剝離雙側(cè)卵巢，去除表面結(jié)締組織，稱重，保存于10% (φ)甲醛溶液中，用于 HE染色。待血清析出后2 000 r/min離心10 min分離血清，于-30℃冰箱保存待檢。

放射免疫法測定血清空腹胰島素(FINS)、瘦素(Leptin)、睪酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)濃度；全自動生化儀測定空腹血糖(FBG)、血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

卵巢指數(shù)＝卵巢質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)[13]。

1.7 卵巢組織學(xué)觀察

每只大鼠的一側(cè)卵巢做病理切片，從卵巢中心沿最長軸在面積最大處進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，HE染色，選擇其中面積最大的3張進(jìn)行分析，光鏡下觀察卵巢組織學(xué)形態(tài)變化，顯微成像系統(tǒng)采集照片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量變化

模型組體質(zhì)量顯著高于對照組和預(yù)防組(P＜0.05)，預(yù)防組和對照組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組卵巢質(zhì)量和卵巢指數(shù)顯著大于對照組和預(yù)防組(P＜0.05)，預(yù)防組和對照組的卵巢質(zhì)量及卵巢指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 3組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body and ovary weight in three groupsof rats(±s，n＝10)

表1 3組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body and ovary weight in three groupsof rats(±s，n＝10)

與對照組比較:?P＜0.05；與模型組比較:＃P＜0.05。

組別 體質(zhì)量/ g卵巢質(zhì)量/ mg卵巢指數(shù)/ (mg·100 g－1)對照組 264.2±19.24 48.57±1.52 18.44±0.94模型組 306.0±36.43?62.14±1.98?20.52±2.12?預(yù)防組 247.7±8.83＃49.49±1.91＃18.61±0.32＃

2.2 大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化

對照組大鼠卵巢色澤呈淡粉色，表面可見較多黃體；模型組卵巢色澤蒼白，體積較對照組明顯增大，表面見透亮的囊泡，罕見黃體；預(yù)防組卵巢色澤粉紅，表面有較多實質(zhì)的黃體。

2.3 大鼠動情周期變化

對照組大鼠有4～5 d的規(guī)律動情周期，由動情間期進(jìn)入動情前期、動情期和動情后期，再過渡到動情間期，開始下一個循環(huán)；模型組大鼠灌胃數(shù)天后失去規(guī)律的動情周期，始終處于動情間期，無排卵，陰道涂片示大量白細(xì)胞，偶見有核上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞；預(yù)防組大鼠經(jīng)由短暫的動情周期紊亂，從干預(yù)的第7天起逐漸恢復(fù)為規(guī)律的動情周期。見圖1。

2.4 大鼠血清學(xué)指標(biāo)

2.4.1 血清性激素水平比較 模型組大鼠血清T、LH濃度顯著高于對照組，P、E2、FSH濃度顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；預(yù)防組大鼠血清T、LH濃度明顯低于模型組，E2、FSH濃度顯著高于模型組，P濃度明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 3組大鼠血清性激素比較Table 2 Comparison of serum sex hormones in three groups of rats(±s，n＝10)

表2 3組大鼠血清性激素比較Table 2 Comparison of serum sex hormones in three groups of rats(±s，n＝10)

與對照組比較:?P＜0.05；與模型組比較:＃P＜0.05。

組別 ρ(T)/(ng·L－1) ρ(P)/(ng·L－1) ρ(E2)/(pg·L－1) ρ(LH)/(mIU·L－1) ρ(FSH)/(mIU·L－1)對照組 0.85±0.65 7.54±0.87 11.00±2.04 4.41±1.02 1.51±0.34模型組 3.47±1.44?3.11±0.71?4.52±1.01?6.85±0.95?0.74±0.37?預(yù)防組 1.03±0.38＃5.21±1.68?＃7.58±1.65＃5.37±0.87＃1.29±0.21＃

2.4.2 血脂、血糖、胰島素和瘦素水平比較 模型組大鼠FINS、Leptin水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)防組大鼠FINS、Leptin、TG水平低于模型組，HDL水平高于模型組并高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。FBG、TC、LDL在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

圖1 大鼠動情周期(瑞氏-吉姆薩染色，200×)Figure 1 Estrous cycles of rats(Wright-Giemsa staining，200×)

2.5 大鼠卵巢形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化

大體標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，預(yù)防組卵巢大小與對照組接近，明顯小于模型組卵巢；鏡下觀察卵巢組織發(fā)現(xiàn):對照組大鼠卵巢內(nèi)部包含多個黃體及不同發(fā)育階段的各級卵泡(包括原始卵泡、初級卵泡、小竇前卵泡、大竇前卵泡、竇狀卵泡、優(yōu)勢卵泡等)，閉鎖卵泡少，卵母細(xì)胞清晰，顆粒細(xì)胞多。模型組大鼠卵巢內(nèi)初級卵泡和閉鎖卵泡增多，并有大量特征性的囊狀擴(kuò)張卵泡，囊內(nèi)未見卵母細(xì)胞及放射冠等基本結(jié)構(gòu)，顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯減少至1～3層，且卵泡膜增厚，間質(zhì)細(xì)胞增生明顯，各階段發(fā)育卵泡均少見，罕見成熟卵泡和黃體。預(yù)防組大鼠卵巢內(nèi)多見竇狀卵泡，偶有特征性囊狀擴(kuò)張卵泡，但有大量各級正常卵泡存在，包括成熟卵泡，并具有相當(dāng)數(shù)量的黃體，未出現(xiàn)明顯的間質(zhì)增生。

表3 3組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、瘦素和血脂比較Table 3 Comparison of fasting glucose and insulin，leptin and blood lipids in three groups of rats(±s，n＝10)

表3 3組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、瘦素和血脂比較Table 3 Comparison of fasting glucose and insulin，leptin and blood lipids in three groups of rats(±s，n＝10)

與對照組比較:?P＜0.05；與模型組比較:＃P＜0.05。

組別 c(FBG)/ (mmol·L－1) ρ(FINS)/ (mIU·L－1) ρ(Leptin)/ (ng·mL－1) c(TC)/ (mmol·L－1) c(TG)/ (mmol·L－1) c(HDL)/ (mmol·L－1) c(LDL)/ (mmol·L－1)對照組 8.47±0.49 22.43±2.35 0.14±0.04 2.06±0.36 0.95±0.34 0.40±0.02 0.18±0.02模型組 8.53±1.30 45.86±12.46?0.44±0.14?1.82±0.41 1.09±0.15 0.35±0.06 0.17±0.02預(yù)防組 8.10±1.14 30.45±4.93＃0.27±0.14＃1.45±0.04 0.52±0.13＃0.45±0.05?＃0.14±0.01

圖2 3組大鼠卵巢組織學(xué)變化(HE染色，200×)Figure 2 Pathological changes of ovary tissue in three groups of rats(haematoxylin-eosin staining，200×)

3 討論

PCOS是育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌和代謝紊亂性疾病，人群發(fā)病率為6%～7%，臨床表現(xiàn)有很高的異質(zhì)性和遠(yuǎn)期并發(fā)癥風(fēng)險[14]。除針對臨床癥狀的對癥治療，目前還沒有任何一種藥物可以一勞永逸地治療PCOS，采取有效的預(yù)防措施是降低發(fā)病率的關(guān)鍵。

本實驗采用來曲唑法造模。來曲唑是一種芳香化酶抑制劑，可阻斷機(jī)體內(nèi)雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，使內(nèi)源性雄激素升高，是其誘導(dǎo)PCOS模型的理論基礎(chǔ)[15]。實驗在PCOS運動干預(yù)療法的基礎(chǔ)上，首次探討運動干預(yù)的預(yù)防效果。在預(yù)防組大鼠接受來曲唑灌胃的同時進(jìn)行運動干預(yù)，并與PCOS模型組和對照組大鼠進(jìn)行比較，評估暴露早期的運動干預(yù)能否作為一級預(yù)防手段阻止PCOS發(fā)生。

實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠始終處于動情間期，稀發(fā)排卵或無排卵。與對照組相比，模型組大鼠T、LH濃度顯著升高，P、E2、FSH濃度顯著降低，卵巢內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒細(xì)胞層明顯減少的特征性囊狀擴(kuò)張卵泡。依據(jù)鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，證實PCOS造模成功。同時，模型組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量明顯高于對照組，與臨床上PCOS患者多數(shù)伴發(fā)肥胖的現(xiàn)象一致。另外，模型組大鼠存在瘦素和胰島素抵抗，與文獻(xiàn)報道一致[17-19]。接受21 d運動干預(yù)的預(yù)防組大鼠未出現(xiàn)上述癥狀，且生理生化指標(biāo)較模型組大鼠有很大改變:從運動干預(yù)的第7天起，預(yù)防組大鼠由動情間期逐漸恢復(fù)規(guī)律的動情周期；干預(yù)結(jié)束后，卵巢內(nèi)可見大量各級發(fā)育卵泡，并有相當(dāng)數(shù)量的黃體，囊狀擴(kuò)張卵泡罕見，提示預(yù)防組大鼠基本恢復(fù)排卵功能。相比于模型組，預(yù)防組大鼠血清T、LH水平顯著降低，F(xiàn)SH水平升高，均達(dá)到正常水平，P、E2濃度也大幅升高。大鼠未發(fā)生肥胖，卵巢質(zhì)量也小于模型組。FINS、Leptin、TG水平均降低至正常水平，HDL水平升高并超過對照組水平。分析預(yù)防組大鼠發(fā)生作用的原因可能是由于運動提高了肌肉組織對胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗，從而降低血中雄激素水平。低水平的胰島素又減輕了其對垂體的直接刺激，減少LH分泌，避免卵泡膜細(xì)胞合成過多雄激素，降低卵巢內(nèi)雄激素水平。運動通過影響下丘腦-垂體-卵巢軸，負(fù)反饋增強(qiáng)了FSH的分泌，使得原本受到來曲唑抑制的芳香化酶重新或部分激活，促進(jìn)卵巢的雌激素合成。這樣，在內(nèi)源性雄激素水平降低、卵巢內(nèi)雌激素升高的條件下，促進(jìn)優(yōu)勢卵泡的發(fā)育直至成熟后排卵，保證了黃體的形成和高水平孕酮的釋放，最終恢復(fù)正常的卵巢組織學(xué)形態(tài)和功能。另外，由于運動時腎上腺素、去甲腎上腺素分泌增加，脂蛋白酯酶活性升高，加速脂肪分解，從而減輕體質(zhì)量，降低血中TG和LDL濃度，提高HDL濃度，減少脂肪在心臟、血管和肝臟等器官的沉積，預(yù)防心腦血管病變[20]。

綜上所述，在暴露于來曲唑的情況下，早期適量的運動干預(yù)能夠降低大鼠的雄激素水平，促進(jìn)排卵，減輕胰島素抵抗，阻止PCOS發(fā)生，同時具有保護(hù)心血管的功能，是預(yù)防PCOS的有效措施，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:幸建華)

Effect of exercise intervention on the occurrence of polycystic ovary syndrome in rats

CAO Sifan1，WU Minmin1，JIANG Liyan2，3
(1.School of Public Health；2.School of Clinical Medicine；3.First Affiliated Hospital，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510000，China)

ObjectiveTo study the impact of exercise intervention on the occurrence of polycystic ovary syndrome(PCOS)and assess the effect of early intervention as a preventive method of PCOS.Methods30 SD rats were randomly divided into three groups，with 10 rats in each group.The control group wasn’t treated.The model and prevention groups were administrated with letrozole to induce PCOS.The prevention group was also accepted exercise intervention.Serum sex hormone，fasting insulin and leptin were detected by radioimmunoassay.Blood lipids and fasting glucose were measured by automatic biochemical analyzer. The pathological changes of ovary tissue were observed by using haematoxylin-eosin staining.ResultsCompared with the control group，the model group rats were fat and had disordered estrous cycles，and large numbers of cystic follicles were observed in ovaries.The concentrations of serum testosterone(T)，luteinizing hormone(LH)，fasting insulin(FINS)and leptin were significantly increased，but the levels of progesterone(P)，estradiol(E2)and follicle stimulating hormone(FSH)markedly decreased.The differences were statistically significant(P＜0.05).The rats in the prevention group were non-obese and had normal estrous cycles，with all kinds of developing follicles in their ovaries.The concentrations of T，LH，F(xiàn)INS and leptin were notably decreased compared to the model group，but FSH and E2levels were dramatically increased(P＜0.05).The concentration of P was promoted compared to the model group，but still lower than the control(P＜0.05).HDL level was prominently elevated and even exceeded the control(P＜0.05).ConclusionThe early intervention with moderate exercise can reduce androgen level and insulin resistance in PCOS rats，promote ovulation and restrain PCOS from happening.It can protect cardiovascular system functions as well，which means an effective measure of preventing PCOS.

polycystic ovary syndrome；rat model；exercise intervention；prevention

R711.75

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.022

1006-8783(2015)05-0656-05

2015-06-11

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目(A2015424)；廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項資金自然科學(xué)類一般項目(156012)

操思凡(1990—)，女，2013級碩士研究生，Email:happy＿csf＠m(xù)sn.com；通信作者:蔣立艷(1966—)，女，副教授，主要從事不孕癥、卵巢腫瘤及滋養(yǎng)細(xì)胞疾病研究，Email:jlyby＠sina.com。

時間:2015-09-24 16:06

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1606.006.html