郭小元，張旭東，游娟，張娟輝，顏麗云，施文敏，馮秋蓉，唐松山

環(huán)磷酰胺對不同雄性實驗動物生殖的影響

郭小元1，張旭東2，游娟1，張娟輝2，顏麗云1，施文敏1，馮秋蓉1，唐松山1

(1.廣東藥學院基礎學院，廣東廣州510006；2.廣東武警醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510507)

目的研究環(huán)磷酰胺對雄鼠生殖系統(tǒng)的影響，為雄性不孕模型的建立提供實驗參考。方法以雄性昆明小鼠、SD大鼠和中華倉鼠為研究對象，每種動物分為生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組。小鼠腹腔給藥200 mg/ (kg·周)，共5周；大鼠灌胃給藥40 mg/(kg·d)，共4周；倉鼠腹腔給藥30 mg/(kg·周)，共5周。各動物每周稱質(zhì)量1次，觀察活動情況，計算存活率。建模后，觀察睪丸鏡下形態(tài)學變化。結(jié)果環(huán)磷酰胺組動物活動度變差，毛發(fā)變稀疏，體質(zhì)量明顯降低。小鼠、大鼠和倉鼠環(huán)磷酰胺組存活率分別為100%、20% (P＜0.01)和80%(P＜0.05)。鏡下檢查發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺組睪丸曲精管有空泡，生精細胞排列混亂，管腔內(nèi)精子減少。結(jié)論環(huán)磷酰胺可明顯引起實驗動物睪丸組織損傷。昆明小鼠對環(huán)磷酰胺耐受性最高，但睪丸太小，不易觀察。SD大鼠非常敏感，死亡率很高。中華倉鼠耐受性良好，睪丸體積較大，適合建立不育模型。

環(huán)磷酰胺；睪丸；雄性不孕；中華倉鼠

隨著社會的發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴重，與之俱增的工作壓力及長期不良的生活習慣，導致現(xiàn)在不孕不育夫婦的人數(shù)越來越多。根據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，我國育齡人群中約15%的夫婦患不孕不育癥，其中男女雙方各占50%[1]。因此尋找更好的治療手段，開發(fā)出更有效的治療藥物對改善當前不孕不育的現(xiàn)狀具有重要的意義，而建立良好的不孕不育動物模型將成為醫(yī)藥學研究成功的關(guān)鍵。

文獻報道，昆明小鼠、SD大鼠是建立不孕不育實驗動物模型的常用動物[2]；主要誘導藥物有環(huán)磷酰胺[3]、腺嘌呤[4]、達菲林[5]等；給藥方式主要是腹腔注射和灌胃[6]。在生物學研究中，小鼠具有遺傳結(jié)構(gòu)清晰，繁殖周期短，近交系繁育簡便，體型小，實驗中通常以腹腔注射的給藥方式建立模型[7]，但其睪丸體積較小，不易觀察。SD大鼠是一種封閉群鼠，繁殖力強，性周期短而穩(wěn)定，受孕率較高，實驗中通常以胃管給藥的方式建立模型[8]。中國倉鼠為小型哺乳動物，體形肥胖，尾較短，吻鈍且短，口腔內(nèi)有頰囊，睪丸較大，特別是其GHRH結(jié)構(gòu)與人有93%同源性，故適用于作為醫(yī)學不孕不育實驗動物模型[9]。環(huán)磷酰胺是臨床上常用的抗腫瘤藥物[10]，對快速增殖的細胞有明顯毒性，如睪丸生精能力損害造成精子減少或死精癥，因而導致機體不孕不育[11]。本文探討了環(huán)磷酰胺對昆明小鼠、SD大鼠以及中華倉鼠生殖系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明小鼠:5周齡雄性SPF級昆明小鼠20只，體質(zhì)量18～28 g，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2013-0020；SD大鼠:8周齡，雄性SD大鼠，16只，體質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2011-0029；中華倉鼠:5周齡雄性中華倉鼠20只，體質(zhì)量18～22 g，成都達碩動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2013-24。

1.1.2 試劑 環(huán)磷酰胺，200 mg/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，0.9%無菌生理鹽水，青島首和金海制藥有限公司。

1.1.3 主要儀器 CX31光學顯微鏡 (日本奧林巴斯)；V9.0明美顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)(廣州市明美科技有限公司)；電子分析天平(華捷電子儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 昆明小鼠:按完全隨機分組，且組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組各10只。實驗組腹腔注射環(huán)磷酰胺，每次給藥劑量為200 mg/kg，每周注射1次，共注射5周。生理鹽水組僅注射相應量的生理鹽水。實驗方法參見文獻[12]。SD大鼠:按完全隨機分組，且組間體質(zhì)量無差異。生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組各8只，環(huán)磷酰胺劑量為40 mg/(kg·d)，灌胃給藥4周，生理鹽水組給予生理鹽水。方法參見文獻[13]。中華倉鼠:按完全隨機分組，且組間體質(zhì)量無差異。生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組各10只，以腹腔注射的方式給藥，共5周，每周1次，給藥劑量為30 mg/kg。實驗方法參見昆明小鼠[14]。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 一般指標 動物每周給藥前稱質(zhì)量1次，觀察動物在建模期間的體質(zhì)量變化。每天觀察動物的活動情況、毛色和身體其他部位是否有異樣。統(tǒng)計建模期間動物的存活率。

1.2.2.2 病理切片 昆明小鼠和中華倉鼠喂養(yǎng)5周，SD大鼠喂養(yǎng)4周后，頸椎脫臼處死，取睪丸，稱質(zhì)量，切片，HE染色。觀察睪丸切片 HE染色結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計學處理 體質(zhì)量比較采用t檢驗，動物存活率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物的一般情況

環(huán)磷酰胺組毛色黯淡，活動度變差。與生理鹽水組比較，環(huán)磷酰胺組體質(zhì)量增長受到抑制(圖1)。由于各動物對環(huán)磷酰胺的耐受性不同，存活率有明顯差異(圖2)。

昆明小鼠:隨著環(huán)磷酰胺給藥時間的增加，小鼠的毛發(fā)漸漸變稀疏，活動狀態(tài)較生理鹽水組差。與生理鹽水組比較，昆明小鼠在給予環(huán)磷酰胺后體質(zhì)量下降明顯，到第 5周差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。5周后，生理鹽水組和環(huán)磷酰胺組動物存活率均為100%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 3種動物每周平均體質(zhì)量比較Figure 1 Changes of body weight in three animals

SD大鼠:隨著環(huán)磷酰胺給藥時間的增加，環(huán)磷酰胺組有部分大鼠出現(xiàn)毛色干枯，精神狀態(tài)不佳，背部彎曲，打嗝，眼、口、鼻、生殖系統(tǒng)以及大便出現(xiàn)出血等癥狀。環(huán)磷酰胺組大鼠的體質(zhì)量一直呈下降趨勢，第4周體質(zhì)量下降最明顯(P＜0.01)。環(huán)磷酰胺組大鼠存活率為20%，與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

中華倉鼠:隨著環(huán)磷酰胺給藥時間的增加，倉鼠體毛黯淡無光澤，并伴有脫毛現(xiàn)象，進食減少，大便稀溏，有部分倉鼠常常雙眼緊閉，活動性變差。給藥5周后，環(huán)磷酰胺組與生理鹽水組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，環(huán)磷酰胺組動物存活率80%，與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 3種實驗動物存活率比較Figure 2 Comparison of survival rates among three animals

2.2 睪丸切片染色分析

見圖3。生理鹽水組睪丸組織正常，生精小管呈飽滿橢圓形，曲細精管上皮細胞排列緊密有序，有3～8層上皮細胞，中央有明顯的中空管腔，有明顯細胞間質(zhì)。環(huán)磷酰胺組管腔內(nèi)精子減少，各級生精細胞排列混亂，中空管腔均減小。昆明小鼠環(huán)磷酰胺組曲精小管直徑減小，間質(zhì)細胞增多。SD大鼠環(huán)磷酰胺組生精上皮脫落及排列紊亂，上皮細胞出現(xiàn)環(huán)狀間隙，大部分管腔充滿脫落的生精細胞，管腔消失。中華倉鼠環(huán)磷酰胺組曲細精管疏松分布，各生精小管間隙擴大，間質(zhì)細胞減少，并有明顯腫脹和病理空泡，上皮細胞向管腔擴散，管腔變小。

圖3 睪丸光鏡觀察結(jié)果(HE染色，40×)Figure 3 Morphological changes in testis observed by microscope

3 討論

環(huán)磷酰胺為細胞毒性藥物，是臨床上常用的免疫抑制劑和抗腫瘤藥。環(huán)磷酰胺對快速生長的細胞產(chǎn)生毒性，如男性睪丸的生精功能障礙，導致無精或少精，誘導精子染色體發(fā)生畸變等。國內(nèi)外有關(guān)用環(huán)磷酰胺建立動物不孕不育模型的研究報道很多，本研究根據(jù)影響因子較高的文獻做了大量預實驗進行了驗證，其結(jié)果與報道的結(jié)果大相徑庭，比如劉志敏等[13]分別以10、20、40、80、100 mg/(kg·d)的劑量，大鼠胃管給藥環(huán)磷酰胺，喂養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)，40mg/(kg·d)劑量組動物的存活率為93.8%，而本實驗結(jié)果僅20%。本研究也用80和100 mg/(kg·d)劑量灌胃，但死亡率更高，無法后續(xù)研究。根據(jù)Tripathi等[12]的研究，本課題組分別以50、100、200 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，結(jié)果顯示，各劑量組小鼠存活率100%。由于昆明小鼠睪丸太小，而且后續(xù)的治療化合物為新型生長激素釋放激素類似肽(hGHRH類似肽)，通過GHRH同源性分析，中華倉鼠的天然GHRH分子與人GHRH有93%同源性。所以，根據(jù)昆明小鼠劑量，本研究用20、30、50、100 mg/kg劑量腹腔注射中華倉鼠作預實驗，發(fā)現(xiàn)30 mg/kg的劑量為最佳劑量，達到80%成活率。

本實驗以腹腔注射或胃管給藥的方式建立不孕不育動物模型，建模后達到性成熟期的10周齡昆明小鼠、12周齡SD大鼠和10周齡中華倉鼠作為研究對象，觀察環(huán)磷酰胺對實驗動物睪丸的影響。從實驗結(jié)果可以看出，環(huán)磷酰胺能引起雄鼠睪丸生殖細胞增殖抑制，隨劑量增高，毒副作用增強。給藥方式對實驗結(jié)果也有很大影響，灌胃給藥對鼠口腔、胃腸和生殖器的刺激性較大，出現(xiàn)口腔、生殖器和大便出血。

本實驗結(jié)果表明，雄性昆明小鼠、SD大鼠和中華倉鼠經(jīng)過環(huán)磷酰胺給藥后，動物體質(zhì)量增長受到抑制，隨劑量增高引起中毒表現(xiàn)更明顯，活動性變差、毛發(fā)變得干枯。與生理鹽水組相比，體質(zhì)量增長受到抑制。在鏡檢中發(fā)現(xiàn)，曲精管腫脹、空泡和畸變率增加。與昆明小鼠和SD大鼠相比，中華倉鼠更適合作為后續(xù)實驗的不孕不育模型，因為中華倉鼠睪丸體積較大和其GHRH分子與人同源性高等特點，降低了實驗種族差異，這對藥物的臨床實驗提供更可靠的前提。睪丸病理切片顯示，中華倉鼠的睪丸病理變化比其他兩種鼠明顯，更易觀察。綜上所述，環(huán)磷酰胺腹腔注射中華地鼠建立不孕不育動物模型可行，而且動物體積小，給藥量小，操作簡單，造模時間短，造模成功率高。

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(責任編輯:幸建華)

Effect of cyclophosphamide on different male experimental animals

GUO Xiaoyuan1，ZHANG Xudong2，YOU Juan1，ZHANG Juanhui2，YAN Liyun1，SHI Wenmin1，F(xiàn)ENG Qiurong1，TANG Songshan1
(1.School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Obstetrics＆Gynecology，Guangdong Provincial Corps Hospital，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510507，China)

ObjectiveTo explore the impact of cyclophosphamide on the reproductive system of male animals.MethodsThe Kunming male mice，SD rats and Chinese hamsters were divided into saline and cyclophosphamide groups.Mice were intraperitoneally injected cyclophosphamide with 200 mg/kg every week for five weeks.SD rats were intragastrically administered cyclophosphamide with 40 mg/kg every week for four weeks.Hamsters were intraperitoneally injected cyclophosphamide with 30 mg/kg every week for five weeks.All animals were weighed per week.Their general activities and fur colors were observed and their survival rates were recorded.After the animals were modeled，the morphology of testis was observed under microscope.ResultsCompared with the saline animals，the activities of animals in the cyclophosphamide group were weak，their furs became thin and their weights were reduced significantly.The survival rates of KM mice，SD rats，and hamster were 100%，20%and 80%，respectively.The seminiferous tubules displayed vacuoles and swelling.The arrangement of spermatogenic cells was in chaos and sperms in seminiferous tubules became less.ConclusionCyclophosphamide can cause significant damages to the animal testicles. Kunming mice have strong tolerance to cyclophosphamide，but their testes are very small.SD rats are very sensitive to cyclophosphamide.The tolerance of Chinese hamsters is stronger and their testes are larger and easy to observe.So the hamsters are adequate to establish the animal models.

cyclophosphamide；testis；male infertility；Chinese hamsters

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.018

1006-8783(2015)05-0638-04

2015-05-15

國家自然基金項目(81001391)；廣東省自然基金項目(2014A030313589，2015A030313843)；教育部留學基金項目(44143012)

郭小元(1988—)，女，2013級碩士研究生；通信作者:唐松山(1965—)，男，教授，碩士生導師，主要從事內(nèi)分泌肽原蛋白蛋加工和臨床疾病研究，Email:songstang＠hotmail.com。

時間:2015-09-24 15:58

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1558.002.html