吳依娜，尹西拳，孔秀娟，張蓓，邱晶晶，賴小平，李耿

地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠免疫功能的影響

吳依娜，尹西拳，孔秀娟，張蓓，邱晶晶，賴小平，李耿

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

目的觀察3種地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠免疫功能的影響，并從基因水平探討其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。方法采用氫化可的松注射液肌注2周造成腎陽(yáng)虛大鼠模型，造模成功后，六味、桂附、知柏地黃丸連續(xù)灌胃給藥3周，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清IL-2及IL-4的含量，熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與正常組比較，模型組胸腺質(zhì)量顯著下降，血清IL-2、IL-4水平顯著改變(P＜0.05)；與模型組比較，桂附地黃丸、六味地黃丸均可顯著提高胸腺質(zhì)量，改善血清IL-2、IL-4水平(P＜0.05)，知柏地黃丸無(wú)顯著改變作用(P＞0.05)；與模型組比較，六味、桂附地黃丸各組均可顯著降低大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，知柏地黃丸無(wú)顯著改變作用(P＞0.05)。結(jié)論六味地黃丸、桂附地黃丸對(duì)于腎陽(yáng)虛大鼠免疫功能有一定的改善作用，知柏地黃丸改善作用不顯著。

氫化可的松；地黃丸類方；免疫；NF-κB通路

腎陽(yáng)虛證為中醫(yī)的基本證型之一，臨床主要表現(xiàn)為面色晄白、形寒肢冷、精神不振、腰膝酸冷、陽(yáng)痿陰縮、遺精尿頻、小便清長(zhǎng)、余瀝不凈、夜尿頻多，女子帶下清稀、宮寒不孕，或尿少心悸、肢腫氣短、喘咳痰飲等，舌淡苔白潤(rùn)，脈虛弱無(wú)力[1]。研究發(fā)現(xiàn)腎虛證與T淋巴細(xì)胞的變化密切相關(guān)，而人體的T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓干細(xì)胞，在胸腺中分化成熟，是免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，也是最重要的免疫細(xì)胞，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫[2]。目前腎虛本質(zhì)的研究主要集中在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、自由基、衰老等方面[3-4]。本研究采用經(jīng)典腎陽(yáng)虛造模方法用氫化可的松注射液肌注2周造成腎陽(yáng)虛大鼠模型，通過(guò)應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清IL-2及IL-4的含量；應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)水平，評(píng)價(jià)地黃丸類方對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠免疫功能的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0020。

1.2 藥物與試劑

六味地黃丸(河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào):120309)；知柏地黃丸(河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào):120301)；桂附地黃丸(河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào):120402)；氫化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào):1110211)；無(wú)菌生理鹽水(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào): 20130621)；RNAiso Plus(TaKaRa BIO INC，Cat.No.＃9108/9109)；PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa BIO INC，Cat.＃RR047A)；氯仿(＞99.8%)、EDTA-2Na· 2H2O、焦碳酸二乙酯(美國(guó)Sigma公司)；Tris(The Dow Chemical Company)；無(wú)水乙醇、異丙醇(廣州化學(xué)試劑廠)；引物(Invitrogen公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

LF26-MESJ分析天平(香港佳立國(guó)際有限公司)；TC-3K電子天平(深圳市華恒科技有限公司)；MC-246歐姆龍?bào)w溫計(jì)[歐姆龍(大連)有限公司]；RT-2100C酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)；FastPrep-24勻漿機(jī)(MP公司)；LX-100手掌型離心機(jī)(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；YXQ-LS-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；GL-3250A磁力攪拌器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；SKG-01電熱恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)；TGL-16G-A冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad)。

2 方法

2.1 分組與造模

取SD大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，雄性，隨機(jī)分為正常組10只，氫化可的松組70只。除正常組肌肉注射等體積生理鹽水外，其余大鼠每天于后肢外側(cè)肌肉注射氫化可的松注射液2.5 mg/100 g，左右后肢交替注射，連續(xù)注射14 d。造模結(jié)束后，即第15天開(kāi)始，除正常組外，其余大鼠按照體質(zhì)量及肛溫隨機(jī)分為模型組、六味地黃丸低(43.2 mg/mL)、高劑量組(172.8 mg/mL)，桂附地黃丸低(40.8 mg/mL)、高劑量組(163.2 mg/mL)，知柏地黃丸低(40.8 mg/mL)、高劑量組(163.2 mg/mL)，每組10只。六味、桂附、知柏地黃丸高、低劑量組分別為灌胃0.9 g/kg和3.6 g/kg(生藥量/體質(zhì)量)混懸液，灌胃體積為10 mL/kg，正常組、模型組給予等體積滅菌蒸餾水，連續(xù)21 d。末次給藥后1 h，10%(φ)水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血5～6 mL，平均分裝于無(wú)肝素鈉離心管和有肝素鈉離心管中，靜止1～2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清、血漿，凍存于－80℃超低溫冰箱中。

2.2 血清IL-2、IL-4水平檢測(cè)

取各組大鼠血清樣品，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4 (IL-4)。

2.3 大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

分別配制 0.5 mol/L，pH8.0的 EDTA溶液、0.1%DEPC水、10×TE Buffer(pH8.0)，將儲(chǔ)存于冷凍柜的各組腎臟組織取出，不可以先行解凍，以避免RNase的作用，提取總RNA，并用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度和A260/A280比值考察RNA純度，在逆轉(zhuǎn)錄作用后，用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)。ΔCt值是NF-κB與內(nèi)參的差值，NF-κB mRNA表達(dá)量采用相對(duì)定量法計(jì)算(2－ΔΔCt)，以正常組為對(duì)照組，計(jì)算各組相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析(ANOVA)法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 地黃丸類方對(duì)胸腺質(zhì)量、血清IL-2、血清IL-4的影響

與正常組比較，模型組胸腺質(zhì)量顯著降低，胸腺明顯萎縮(P＜0.01)，血清IL-2含量顯著降低(P＜ 0.01)，血清IL-4含量顯著升高(P＜0.01)，提示造模成功。與模型組比較，六味地黃丸高、低劑量組和桂附地黃丸高、低劑量組均可顯著提高大鼠胸腺質(zhì)量，升高血清IL-2含量，降低血清IL-4含量，提示六味地黃丸和桂附地黃丸可顯著改善腎陽(yáng)虛大鼠的免疫功能，且桂附地黃丸效果更加顯著，可使其水平恢復(fù)至正常值。見(jiàn)表1。

表1 3種地黃丸類方對(duì)大鼠胸腺質(zhì)量及血清細(xì)胞因子水平的影響Table 1 Effects of three kinds of Dihuangwan class parties on the thymus weight and cytokine levels in rats(±s，n＝10)

表1 3種地黃丸類方對(duì)大鼠胸腺質(zhì)量及血清細(xì)胞因子水平的影響Table 1 Effects of three kinds of Dihuangwan class parties on the thymus weight and cytokine levels in rats(±s，n＝10)

與正常組比較:?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別 劑量/(g·kg－1) m(胸腺)/g ρ(IL-2)/(ng·L－1) ρ(IL-4)/(ng·L－1)正常組 - 0.39±0.04 1028.75±307.54 77.68±5.52模型組 - 0.19±0.03??731.25±78.49??100.09±9.79??六味地黃丸 高劑量組 1.728 0.32±0.06?＃＃876.88±50.3?＃91.21±7.33??＃＃低劑量組 0.432 0.32±0.05?＃＃862.71±53.49??＃91.07±5.24??＃＃桂附地黃丸 高劑量組 1.632 0.38±0.07＃＃1001.67±142.39＃＃79.55±7.45＃＃低劑量組 0.408 0.36±0.08＃＃915.00±116.91＃＃81.85±8.83＃＃知柏地黃丸 高劑量組 1.632 0.22±0.06??846.88±59.1??93.87±6.39??低劑量組 0.408 0.21±0.05??816.88±40.16??95.12±4.24??

3.2 地黃丸類方對(duì)大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)的影響

核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定各管總RNA的A260/A280比值均在2.0左右，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量和純度符合要求。熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1、2所示，目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線均光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜的S形曲線形狀完好，符合定量檢測(cè)要求；完成擴(kuò)增后，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物均可形成良好的熔解曲線峰形，表明不存在引物二聚體或非特異性產(chǎn)物等的干擾。

各組目的基因相對(duì)表達(dá)量如表2所示，與模型組比較，六味地黃丸高、低劑量組、桂附地黃丸高、低劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)，知柏地黃丸高、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與桂附地黃丸組比較，知柏地黃丸高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；其余各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明六味地黃丸、桂附地黃丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使腎陽(yáng)虛大鼠血清細(xì)胞因子水平恢復(fù)正常，從而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫的作用。

表2 3種地黃丸類方對(duì)大鼠NF-κB mRNA表達(dá)的影響Table 2 Effect of three kinds of Dihuangwan class parties on the expression of NF-κB mRNA in rats(±s，n＝3)

表2 3種地黃丸類方對(duì)大鼠NF-κB mRNA表達(dá)的影響Table 2 Effect of three kinds of Dihuangwan class parties on the expression of NF-κB mRNA in rats(±s，n＝3)

與模型組比較:＃＃P＜0.01。

組別 劑量/ (g·kg－1) NF-κB mRNA表達(dá)量正常組 － 1模型組 － 1.08±0.14六味地黃丸 高劑量組 1.728 0.60±0.19＃＃低劑量組 0.432 0.62±0.28＃＃桂附地黃丸 高劑量組 1.632 0.40±0.16＃＃低劑量組 0.408 0.48±0.03＃＃知柏地黃丸 高劑量組 1.632 0.82±0.09低劑量組 0.408 0.85±0.13

圖1 內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curve of internal reference GAPDH

圖2 NF-κB擴(kuò)增曲線Figure 2 Amplification curve of NF-κB

3 討論

地黃丸類復(fù)方最早出現(xiàn)在東漢張仲景的《金匱要略》中，即是后世用來(lái)溫補(bǔ)腎陽(yáng)的“金匱腎氣丸”，又叫腎氣丸、八味腎氣丸、桂附地黃丸。六味地黃丸是在腎氣丸的基礎(chǔ)上減去剛燥的附子、桂枝，改干地黃為熟地黃，組成的滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方。而知柏地黃丸則是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上添加了知母和黃柏兩味藥，常用于治療腎陰虛證。

Th細(xì)胞是T細(xì)胞的其中一個(gè)亞群，通常分為Th1和Th2兩種。Th1主要分泌IL-2，與細(xì)胞免疫有關(guān)；而Th2主要分泌IL-4，與體液免疫有關(guān)。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，Th1和Th2處于動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫功能。當(dāng)機(jī)體受到異己成分攻擊時(shí)，Th1和Th2細(xì)胞中某一亞群功能升高，另一亞群功能降低，出現(xiàn)Th1/Th2漂移現(xiàn)象[5]。

NF-κB是存在于細(xì)胞質(zhì)中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，處于TLR下游信號(hào)通路的樞紐位置。當(dāng)細(xì)胞靜止時(shí)，NF-κB與其抑制單位IκB的中心區(qū)結(jié)合，形成NF-κB＋I(xiàn)κB復(fù)合體。細(xì)胞活化后，復(fù)合體解離進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子等基因轉(zhuǎn)錄，影響Th1促炎細(xì)胞因子和Th2抗炎細(xì)胞因子，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予腎陽(yáng)虛大鼠模型六味地黃丸、桂附地黃丸、知柏地黃丸3種地黃丸類方，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桂附地黃丸、六味地黃丸均可顯著改變血清IL-2、IL-4水平，知柏地黃丸無(wú)顯著性改變作用。模型組大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)量顯著升高，NF-κB異?；罨?，六味、桂附地黃丸均可不同程度降低大鼠腎組織NF-κB mRNA表達(dá)量，其中桂附地黃丸效果最優(yōu)，其與知柏地黃丸存在顯著性差異。

腎陽(yáng)虛證是中醫(yī)臨床上重要的癥候之一，多年來(lái)對(duì)腎陽(yáng)虛證的研究頗多，其與免疫的關(guān)系也是備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)，本研究對(duì)幾種地黃丸類方在腎陽(yáng)虛大鼠免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行比較，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸和桂附地黃丸在免疫功能改善方面表現(xiàn)出一定的相似性，推測(cè)地黃丸類方免疫調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是復(fù)方的“三補(bǔ)”部分。課題前期對(duì)“三補(bǔ)”部分的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)熟地黃、山藥、山茱萸均以多糖為其主要活性成分，大量文獻(xiàn)表明熟地、山藥、山茱萸中主要活性成分多糖的藥理作用主要集中在調(diào)節(jié)免疫方面[7-9]，這也佐證了對(duì)于“三補(bǔ)”部分重在調(diào)節(jié)免疫的分析。而知柏地黃丸則未表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)免疫作用，分析可能與該復(fù)方藥性偏寒有關(guān)，其對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠出現(xiàn)的便溏等虛寒癥狀未有作用，再加上其“三補(bǔ)”組分含量降低導(dǎo)致未能表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用。

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(責(zé)任編輯:幸建華)

Effects of Dihuang wan compound on the immunologic function in kidney deficiency rats

WU Yina，YIN Xiquan，KONG Xiujuan，ZHANG Bei，QIU Jingjing，LAI Xiaoping，LI Geng
(School of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo study the effects and potential mechanisms of three kinds of Dihuangwan class parties on the immunologic function in kidney deficiency rats.MethodsThe classic model was established by intramuscular injection of hydrocortisone two weeks.Liuweidihuangwan，Guifudihuangwan and Zhidihuangwan were intragastrically administrated for three weeks.Serum IL-2 and IL-4 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The expression of NF-κB mRNA in kidney tissue was detected by quantitative PCR.ResultsCompared with the normal group，the thymus weight was decreased，and IL-2 and IL-4 levels were changed in the model group.Treatment with Guifudihuangwan and Liuweidihuangwan，but not Zhibaidihuangwan，significantly restored the thymus weight and altered serum IL-2 and IL-4 levels in rats.Compared with the model group，treatment with Guifudihuangwan and Liuweidihuangwan obviously reduced NF-κB mRNA expression in kidney tissues.ConclusionGuifudihuangwan and Liuweidihuangwan may improve the immunological function in kidney deficiency rats.

hydrocortisone；Dihuangwan class party；immunity；NF-κB pathway

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.016

1006-8783(2015)05-0629-04

2015-05-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U30973945)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新課題(11CX023)

吳依娜(1965—)，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥的配伍與臨床應(yīng)用研究，Email:zywyn＠163.com；通信作者:李耿(1983—)，男，副教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，Email:lg＠gzhtcm.edu.cn。

時(shí)間:2015-09-24 16:01

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1601.004.html