古玉梅，徐長青，洪銘范，鄧雪梅，彭忠興，余青云，危智盛

藥理學

淫羊藿苷對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的治療作用

古玉梅，徐長青，洪銘范，鄧雪梅，彭忠興，余青云，危智盛

(廣東藥學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510080)

目的探討淫羊藿苷(ICA)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的治療作用，及其對血清轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、內(nèi)源性雌激素(E2)水平的影響。方法構(gòu)建EAE小鼠模型，按評分相當原則將EAE小鼠隨機分為雌激素組、高、中、低劑量ICA組、ICA＋ICI組、模型組和正常對照組，觀察給藥前后以及治療后各組間小鼠體質(zhì)量、神經(jīng)功能評分變化及血清E2、TGF-β水平的差異。結(jié)果雌激素組和高劑量ICA組小鼠體質(zhì)量明顯增加，神經(jīng)功能評分明顯改善，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與各ICA治療組比較，ICA＋ICI組未見改善(P＜0.05)。高劑量ICA組E2水平較模型組明顯升高(P＜0.05)；雌激素組和高劑量ICA組血清TGF-β水平與模型組比較明顯增高(P＜0.05)；與高、中劑量ICA組比較，ICA＋ICI組E2水平、TGFβ水平均下降明顯(P＜0.05)。結(jié)論ICA具有擬雌激素樣作用，并可通過增加E2及血清TGF-β水平，達到改善EAE小鼠體質(zhì)量下降及神經(jīng)損害的作用。

自身免疫性腦脊髓炎；淫羊藿苷；雌激素；轉(zhuǎn)化生長因子-β

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)橹饕±硖攸c的自身免疫性疾病。臨床研究表明雌二醇治療可使MS患者磁共振成像病變體積和數(shù)目顯著減少，從而使病情得到緩解[1]；動物實驗也表明雌二醇可使MS模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠病情顯著緩解，或病情不再加重，復發(fā)率減少[2]。采用雌激素治療MS近年受到廣泛關(guān)注，但因雌激素有誘發(fā)腫瘤的風險而存在爭議。淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿的主要活性成分之一，動物實驗表明淫羊藿具有較強雌激素樣作用，而ICA是其發(fā)揮雌激素活性的主要物質(zhì)，可以模擬、干擾雌激素的生理生化作用[3-4]。本研究選用具有雌激素樣作用的ICA，通過其對EAE小鼠模型的體質(zhì)量變化、神經(jīng)功能評分、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、內(nèi)源性雌激素(estradiol，E2)水平的影響，探討ICA對EAE小鼠的治療作用，為ICA治療MS的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取60只SPF級C57BL/6雌性小鼠，7～9周齡，體質(zhì)量16～22 g，購于廣東省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2012-2015。飼養(yǎng)3 d后54只用于構(gòu)建模型，6只作為正常對照組。

1.2 藥品和試劑

髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35-55)、百日咳毒素(ENZO公司)；滅活結(jié)核分枝桿菌(美國Difco公司)；多聚甲醛(上海生物工程有限公司)；戊巴比妥鈉(上海試劑一廠)；不完全弗氏佐劑、淫羊藿苷、雌激素受體阻斷劑ICI182，780(美國Sigma)；己烯雌酚(上海阿拉丁公司)；雌激素放免試劑盒、TGF-β ELISA試劑盒(上?，庬嵣锟萍加邢薰?。

用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)將MOG35-55稀釋成質(zhì)量濃度為600 μg/mL，然后加入等體積的完全弗氏佐劑(滅活結(jié)核分枝桿菌的終質(zhì)量濃度為5 mg/mL)混合，用電動攪拌器充分攪拌乳化，直至乳化液滴入水中呈油包水狀，制成抗原乳劑，放置于4℃冰箱保存并在12 h內(nèi)用完。對小鼠進行稱質(zhì)量，然后按0.1 mL/20 g予以1%(φ)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將抗原乳劑接種于小鼠脊柱兩側(cè)皮下(分為4個部位，每個部位50 μL)，第7天再次注射等劑量MOG35-55/完全弗氏佐劑混合液加強免疫。同時于免疫后第0及48 h腹腔注射500 ng百日咳毒素。本組小鼠第9天開始發(fā)病，第12～13天神經(jīng)功能損害達高峰。

1.4 分組與給藥

造模過程中，密切觀察小鼠的癥狀，進行稱質(zhì)量，并根據(jù)Becher[6]的標準對EAE小鼠進行神經(jīng)損害程度評分。將評分1分以上的36只小鼠納入實驗，并按評分相當原則將其隨機分為6組，每組6只:雌激素組，給予己烯雌酚0.2 mg/(kg·d)灌胃；高、中、低劑量ICA組，分別給予ICA 300 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)灌胃；ICA＋ICI組，給予ICA150 mg/(kg·d)灌胃加ICI182，780 1 mg/ (kg·d)皮下注射；模型組，給予等容量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃；正常對照組，給予等容量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。造模前各組間神經(jīng)損害程度評分差異無統(tǒng)計學意義。給藥在造模后第13天小鼠發(fā)病高峰期開始，連續(xù)5 d。

1.5 觀察指標

給藥前后測定小鼠體質(zhì)量、神經(jīng)功能評分，并將小鼠處死取材。首先用1%戊巴比妥鈉0.1 mL/20 g腹腔注射麻醉小鼠，采用眶靜脈取血，放入EP管中室溫下靜置1 h，然后放入4℃的臺式離心機中，12 000 r/min離心30 min，取上清液放入做好標記的EP管中，存放于－80℃冰箱中待檢。按雌二醇試劑盒說明書采用放射免疫法檢測血清中E2水平；按照TGF-βELISA試劑盒說明書的步驟測定血清中細胞因子TGF-β水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

自身污染主要是指在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中因一些養(yǎng)殖行為造成的水污染。這些影響因素主要有苗種、肥料、魚藥、環(huán)境改良劑、糞便以及排泄物、底部沉積物等。具體來說：

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體質(zhì)量及神經(jīng)功能評分變化

2.1.1 小鼠體質(zhì)量變化 體質(zhì)量變化比較，與造模前比，各組小鼠造模后均明顯下降(P＜0.05)。與模型組比，治療后雌激素組和高劑量ICA組明顯增加(P＜0.05)，中、低劑量ICA組及ICA＋ICI組治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ICA＋ICI組較雌激素組及高、中劑量ICA組降低明顯(P＜0.05)，而與低劑量ICA組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠在不同造模時間的體質(zhì)量比較Table 1 Changes of mice weight in different groups(±s，n＝6)

表1 各組小鼠在不同造模時間的體質(zhì)量比較Table 1 Changes of mice weight in different groups(±s，n＝6)

與造模前比較:△P＜0.05；與治療前比較:?P＜0.05；與模型組比較:＃P＜0.05；與ICA＋ICI組比較:▲P＜0.05。

組別 劑量/(mg·kg－1) 造模前/g 治療前/g 治療后/g正常對照組 － 16.3±0.12 16.6±0.11 16.8±0.12模型組 － 17.4±0.11 15.9±0.12△15.7±0.13雌激素組 0.2 17.3±0.12 15.8±0.12△17.8±0.11??！邉┝縄CA組 300 17.9±0.12 16.6±0.12△18.0±0.11??！袆┝縄CA組 150 17.3±0.12 15.2±0.11△15.7±0.13▲低劑量ICA組 50 17.8±0.11 15.4±0.13△15.6±0.12 ICA＋ICI組 150，1.0 16.8±0.13 14.8±0.12△14.5±0.13

2.1.2 小鼠神經(jīng)功能評分變化 小鼠神經(jīng)功能評分比較，治療后雌激素組及高劑量ICA組有改善(P＜0.05)，中、低劑量ICA組及ICA＋ICI組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。治療后各組與模型組比較，僅雌激素組和高劑量ICA組有明顯改善(P＜0.05)；ICA＋ICI組較雌激素組及高、中劑量ICA組明顯增高(P＜0.05)，與低劑量ICA組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組小鼠治療前后神經(jīng)功能評分比較Table 2 Neurofuction deficiency in different groups(±s，n＝6)

表2 各組小鼠治療前后神經(jīng)功能評分比較Table 2 Neurofuction deficiency in different groups(±s，n＝6)

與治療前比較:?P＜0.05；與模型組比較:△P＜0.05；與ICA＋ICI組比較:＃P＜0.05。

組別 劑量/ (mg·kg－1) 治療前 治療后正常對照組 － 0.0 0.0模型組 － 1.8±0.62 2.0±0.53雌激素組 0.2 2.0±0.21 0.5±0.13?△＃高劑量ICA組 300 2.5±0.21 1.5±0.14?△＃中劑量ICA組 150 2.0±0.16 1.6±0.23＃低劑量ICA組 50 2.0±0.23 1.8±0.21 ICA＋ICI組 150，1.0 2.0±0.14 2.3±0.32

2.2 小鼠血清中E2、TGF-β水平的變化

E2水平比較，與模型組比，高劑量ICA組水平明顯升高(P＜0.05)，中、低劑量ICA組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；ICA＋ICI組較高、中劑量ICA組顯著減低(P＜0.05)，與雌激素組、低劑量ICA組比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TGF-β水平比較，各組均較正常對照組低(P＜0.05)；與模型組比，雌激素組、高劑量ICA組增高明顯(P＜0.05)，與中、低劑量ICA組、ICA＋ICI組比差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)；ICA＋ICI組明顯低于雌激素組和高、中劑量ICA組(P＜0.05)，與小劑量ICA組比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中E2及TGF-β水平比較Table 3 Levels of serum estrogen and TGF-β in different groups(±s，n＝6)

表3 各組小鼠血清中E2及TGF-β水平比較Table 3 Levels of serum estrogen and TGF-β in different groups(±s，n＝6)

與正常對照組比較:△P＜0.05；與模型組比較:?P＜0.05；與ICA＋ICI組比較:▲P＜0.05。

組別 劑量/ (mg·kg－1) ρ(E2)/ (pg·mL－1) ρ(TGF-β)/ (pg·mL－1)正常對照組 － 4.73±0.03 12.00±0.05模型組 － 4.76±0.32 4.95±0.04△雌激素組 0.2 3.52±0.24 10.56±0.03△?▲高劑量ICA組 300 9.26±0.04?▲9.85±0.04△?▲中劑量ICA組 150 7.43±0.03▲8.01±0.04△▲低劑量ICA組 50 5.12±0.02 7.43±0.04△ICA＋ICI組 150，1.0 4.56±0.03 4.62±0.03△

3 討論

臨床及動物實驗均表明雌激素對MS或EAE具有保護作用。然而，大劑量或長期使用雌激素可能引發(fā)雌激素依賴性腫瘤、血栓性疾病、高血壓、水腫等并發(fā)癥。近年研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿具有較強的雌激素活性[3-4]，而ICA是淫羊藿發(fā)揮其雌激素活性的主要物質(zhì)，具有雌激素樣活性作用且較雌激素副作用少，同時還具有心臟保護、神經(jīng)保護、抗炎、抗凋亡等作用，對神經(jīng)變性疾病[7]、慢性炎癥性疾病[8]、糖尿病[9]、骨質(zhì)疏松[10]等均具有潛在的治療作用。然而，ICA在MS或EAE方面的研究甚少，其對EAE的作用機制亦尚不清楚。

本研究對EAE小鼠治療前后以及治療后各組間體質(zhì)量指標、神經(jīng)功能評分進行比較，發(fā)現(xiàn)高劑量ICA與雌激素一樣能改善EAE小鼠體質(zhì)量下降及神經(jīng)功能損害，但中、低劑量作用不顯著；應(yīng)用了雌激素受體拮抗劑ICI182，780后該療效可被阻斷，以上結(jié)果表明ICA可通過擬雌激素樣作用途徑而對EAE起治療作用。本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)高劑量ICA治療組能明顯增加血清E2水平。表明ICA可能同時通過促進E2的分泌而發(fā)揮作用。

目前，研究普遍認為MS患者外周血中調(diào)節(jié)性T細胞有功能障礙，其分泌的TGF-β減少，導致T、B細胞和巨噬細胞活化過度，上調(diào)黏附因子，破壞血腦屏障[11]。TGF-β參與機體的多種免疫反應(yīng)[12-13]:抑制對IL-2依賴的T細胞增殖；抑制IL-2依賴的B細胞分泌IgM；抑制細胞因子TNF-α產(chǎn)生。TGF-β在治療傷口愈合、通過免疫抑制治療自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)方面有確切的作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素和大劑量ICA能提高血清TGF-β水平，表明ICA可通過增加TGF-β水平發(fā)揮抗炎作用，而達到治療EAE的作用。ICA＋ICI組較ICA組明顯減低，表明ICA升高TGF-β的作用可被雌激素受體拮抗劑ICI182，780所阻斷。

綜上所述，本研究證實了ICA具有擬雌激素樣作用，可通過增加血清TGF-β水平，達到改善EAE小鼠體質(zhì)量及神經(jīng)損害的作用，且高劑量ICA組療效較中、小劑量組顯著。ICA對EAE治療作用的機制十分復雜，其發(fā)揮神經(jīng)保護、抗炎、抗凋亡等作用的具體機制有待進一步研究。

[1]STUVE O，YOUSSEF S，STEINMAN L，et al.Statins as potential therapeutic agents in neuroinflammatory disorders [J].Curr Opin Neurol，2003，16(3):393-401.

[2]NIINO M，HIROTANI M，F(xiàn)UKAZAWA T，et al.Estrogens as potential therapeutic agents in multiple sclerosis[J]. Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2009，9(2):87-94.

[3]de NAEYER A，POCOCK V，MILLIGAN S，et al.Estrogenic activity ofa polyphenolic extractofthe leaves of Epimedium brevicornum[J].Fitoterapia，2005，76(1):35-40.

[4]LIU Jian，LOU Yijia.Determination of icariin and metabolites in ratserum by capillary zone electrophoresis: rat pharmacokinetic studies after administration of icariin[J]. J Pharm Biomed Anal，2004，36(2):365-370.

[5]MENDEL I，KERLERO D R N，BEN-NUN A.A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells[J].Eur J Immunol，1995，25(7): 1951-1959.

[6]BECHER B，DURELL B G，NOELLE R J.Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin-12[J].J Clin Invest，2002，110(4):493-497.

[7]ZHANG Lan，SHEN Cong，CHU Jin，et al.Icariin decreases the expression of APP and BACE-1 and reduces the betaamyloid burden in an APP transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J].Int J Biol Sci，2014，10(2):181-191.

[8]WU Jinfeng，DU Juan，XU Chang，et al.In vivo and in vitro anti-inflammatory effects of a novel derivative of icariin[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，138(1):49-54.

[9]QI Minyou，CHEN Kai，LIU Haoran，et al.Protective effect of Icariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factor beta1 and type IV collagen expression in rats[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，138(3):731-736.

[10]HSIEH T P，SHEU S Y，SUN J S，et al.Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2，SMAD4，and Cbfa1 expression[J]. Phytomedicine，2010，17(6):414-423.

[11]HAAS J，HUG A，VIEHOVER A，et al.Reduced suppressive effect of CD4＋CD25 high regulatory T cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in patients with multiple sclerosis[J].Eur J Immunol，2005，35(11):3343-3352.

[12]AKHURST R J，HATA A.Targeting the TGF beta signalling pathway in disease[J].Nat Rev Drug Discov，2012，11 (10):790-811.

[13]PARDALI E，TEN D P.TGF beta signaling and cardiovascular diseases[J].Int J Biol Sci，2012，8(2): 195-213.

(責任編輯:幸建華)

Therapeutic effect of icariin on the experimental autoimmune encephalomyelitis in mice

GU Yumei，XU Changqing，HONG Mingfan，DENG Xuemei，PENG Zhongxing，YU Qingyun，WEI Zhisheng
(The First Affiliated Hospital/Clinical Medical Colleges，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China)

ObjectiveTo study the therapeutic effect of icariin(ICA)on the experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)in mice and its influence on the levels of endogenous estrogen and TGF-β.MethodThe mouse EAE model was established，and divided into seven groups including the estrogen group，three different doses of ICA groups，the ICA with ICI group，the model group and the normal group. The mice weight，clinical symptom scoring，serum estrogen and TGF-β were examined.ResultsCompared with the model group，the mice weight and clinical symptom scoring were significantly improved in both estrogen and high dose of ICA groups.There was no obvious difference between the ICA and ICA with ICI groups.The levels of estrogen were increased in the high dose of ICA group in comparison with that of the model group.The levels of TGF-β were elevated in both estrogen and high dose of ICA groups.Compared with the middle and high groups，the levels of estrogen and TGF-β were decreased in the ICA with ICI group.ConclusionICA displays estrogen－like effect on treatment of EAE through enhancing of estrogen and TGF-β expression，and improving weight loss and nerve damage.

experimental autoimmune encephalomyelitis；icariin；estrogen；transforming growth factor-β

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.013

1006-8783(2015)05-0617-04

2015-09-13

國家自然科學基金項目(44173001)

古玉梅(1985—)，女，2013級研究生；通信作者:洪銘范(1963—)，男，博士生導師，教授，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)免疫性疾病、肝豆狀核變性等研究，Email:hmf9001＠163.com。

時間:2015-10-16 16:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151016.1622.004.html