任晉，廖嫻，謝鎮(zhèn)山，葉家宏，黃月純

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學 第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405)

HPLC法測定刺五加、五加皮與紅毛五加皮中3種成分的含量

任晉1，廖嫻2，謝鎮(zhèn)山1，葉家宏1，黃月純2

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學 第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405)

目的建立刺五加、五加皮、紅毛五加皮中原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸的質(zhì)量分數(shù)測定方法。方法采用HPLC法，色譜柱為Kromasil C18色譜柱；流動相為乙腈-0.1%(體積分數(shù))H3PO4溶液，梯度洗脫；檢測波長為270 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃。結(jié)果刺五加中原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸達到基線分離，線性關(guān)系良好(r≥0.999 9)，平均加樣回收率分別為98.7%、99.7%、101.0%，RSD均小于3.0% (n＝6)。刺五加、五加皮、紅毛五加皮中原兒茶酸質(zhì)量分數(shù)分別為0.022 5～0.028 7、0.076 3～0.132、0.013 8～0.071 2 mg/g；紫丁香苷質(zhì)量分數(shù)分別為0.445～0.616、0.023 8～0.025 9、0.037 3～0.069 3 mg/g；綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為1.834～2.169、0.659～0.713、0.372～0.709 mg/g。刺五加中紫丁香苷、綠原酸質(zhì)量分數(shù)最高，其中紫丁香苷約為五加皮、紅毛五加皮中質(zhì)量分數(shù)的7～25倍，綠原酸約為五加皮、紅毛五加皮中質(zhì)量分數(shù)的3～5倍；而原兒茶酸在五加皮中質(zhì)量分數(shù)最高，其次為紅毛五加皮、刺五加。結(jié)論該方法靈敏、可靠，可用于刺五加、五加皮和紅毛五加皮類藥材質(zhì)量控制的參考。

刺五加；五加皮；紅毛五加皮；原兒茶酸；紫丁香苷；綠原酸；高效液相色譜法

剌五加為五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根、莖及根莖，味辛、微苦，溫。益氣健脾、補腎安神，用于脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛等證[1]192。2010年版《中國藥典》以紫丁香苷(刺五加苷B)質(zhì)量分數(shù)作為刺五加主要質(zhì)量控制指標。文獻研究表明刺五加尚含有綠原酸、原兒茶酸等主要活性成分[2-3]。傳統(tǒng)藥用五加皮品種較混亂[4]，2010年版《中國藥典》收載的五加皮為五加科植物細柱五加Acanthopanax gracilistyl W.W.Smith的干燥根皮(又名南五加皮)[1]61。此外，還有紅毛五加皮，為五加科紅毛五加Acanthopanax giraldii Harms密生刺毛的莖皮，因主產(chǎn)地為四川又名川加皮，收載于《四川省中藥材標準》[5]。因五加皮各地使用習慣差異較大，仍有將紅毛五加皮作五加皮入藥，或?qū)⒋涛寮优c紅毛五加皮混為一體，也作五加皮入藥，導致目前市售五加皮偽劣混用現(xiàn)象極為嚴重，影響了臨床療效。據(jù)文獻報道，五加皮含原兒茶酸[6]、綠原酸[7]、紫丁香苷[8]等成分，紅毛五加亦含有綠原酸[9]、紫丁香苷[10]、原兒茶酸[11]等成分，尚未見同時測定上述3種成分以評價刺五加、五加皮、紅毛五加皮質(zhì)量差異的報道。本研究采用高效液相色譜法(HPLC法)測定，同時比較刺五加、五加皮、紅毛五加皮中紫丁香苷、綠原酸、原兒茶酸的質(zhì)量分數(shù)差異，為這3種藥材的成分及質(zhì)量分析提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

藥材分別購于廣東多家藥材公司與藥店(見表1)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定，分別為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根、莖及根莖，五加科植物細柱五加Acanthopanax gracilistyl W.W. Smith的干燥根皮以及五加科紅毛五加Acanthopanax giraldii Harms的干燥莖皮；原兒茶酸對照品(批號為:110809-200503)，綠原酸對照品(批號為:0753-200111)均購自中國藥品生物制品檢定所；紫丁香苷對照品(批號為:111574-200603)購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，Merk公司；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別取原兒茶酸對照品、紫丁香苷對照品、綠原酸對照品適量，精密稱定，加80%(體積分數(shù)，下同)甲醇制成每1 mL含原兒茶酸55.0 μg、紫丁香苷100 μg、綠原酸306 μg的混合對照品溶液，即得。

表1 12批樣品的來源Table 1 The sources of 12 batches of samples

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過4號篩)約1.0 g，精密稱定，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過。濾液減壓蒸至近干，殘渣加甲醇溶解，置2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動相為乙腈(A)-0.1%(體積分數(shù))H3PO4(B)，梯度洗脫:0～8 min，14%A→16%A，8～15 min，16%A→18%A，15～30 min，18%A→20%A，30～40 min，20%A→100%A，40～50 min，100%A，50～60 min，100%A→14%A；檢測波長為270 nm；柱溫為30℃。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，依法測定。結(jié)果表明3種成分的色譜峰分離度符合要求。見圖1。

圖1 刺五加(A)、五加皮(B)、紅毛加皮(C)和混合對照品(D)溶液的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis(A)，Acanthopanacis Cortex(B)and Acanthopanax giraldii Cortex(C)and mixed reference substances(D)

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取原兒茶酸對照品溶液(每1 mL中含原兒茶酸0.550 mg)、紫丁香苷對照品溶液(每1 mL中含紫丁香苷0.496 mg)及綠原酸對照品溶液(每1 mL含綠原酸2.511 mg)各0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL，置5 mL容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液5 μL，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。以進樣量為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，結(jié)果原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸的回歸方程分別為:Y ＝5.567 4×103X－11.717(r＝1.000 0)、Y＝2.398 3× 103X－0.586 1(r＝0.999 9)、Y＝8.596 2×102X＋19.245 (r＝0.999 9)，原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸對照品分別在0.011 0～0.550，0.009 92～0.496，0.050 2～2.511 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

分別精密吸取原兒茶酸對照品、紫丁香苷對照品、綠原酸對照品溶液5 μL，按“2.3”項下方法連續(xù)進樣6次，結(jié)果原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸峰面積的RSD值分別為0.89%、0.55%、0.64%，表明方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，按“2.3”項下方法測定，結(jié)果原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸峰面積的RSD值分別為0.61%、0.74%、0.93%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一份樣品(CWJ-1)6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法進樣分析，計算3種成分的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.027 0、0.605、1.946 mg/g，RSD分別為1.06%、0.92%、0.82%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知質(zhì)量分數(shù)的同一批樣品(CWJ-1)粉末6份，約0.5 g，精密稱定，分別精密加入原兒茶酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為7.2 μg/mL)、紫丁香苷對照品溶液(質(zhì)量濃度為103 μg/mL)、綠原酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為195 μg/mL)各2、3、5 mL，再精密加入80%甲醇15 mL，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定并計算加樣回收率，結(jié)果表明加樣回收率良好。見表2。

2.9 樣品的測定

分別精密吸取原兒茶酸對照品、紫丁香苷對照品、綠原酸對照品溶液及供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，按“2.3”項下方法測定峰面積，按外標法計算樣品中3種成分的質(zhì)量分數(shù)，見表3。

3 討論

本研究分別考察了60%(體積分數(shù))乙醇、60% (體積分數(shù))甲醇、80%(體積分數(shù))甲醇、甲醇提取的效果，結(jié)果80%甲醇的提取效果最好；篩選了30、45、60 min不同超聲處理時間，結(jié)果超聲處理45 min可基本提取完全；比較超聲處理1、2次的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超聲1次已基本提取完全。最終確定采用80%甲醇超聲處理1次的提取方法。

表2 刺五加中3種主要成分的加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery results of the three constituents of Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis(n＝6)

表3 12批樣品中原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸的質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果Table 3 Mass fraction results of protocatechuic acid，syringin and chlorogenic acid in 12 batches of samples(n＝2)

紫丁香苷又稱刺五加苷B，是刺五加的主要有效成分，文獻報道具有很強的止血作用[12]以及降血脂[13-14]、抗氧化[15]等藥理作用；綠原酸具有較強的生物活性，有廣泛的抗菌作用[16]；原兒茶酸具有抗菌、祛痰、平喘作用[17-18]。紫丁香苷、綠原酸和原兒茶酸都具有較強生理活性，是刺五加、五加皮、紅毛五加皮發(fā)揮藥效作用的主要成分，故確定了將這3種成分質(zhì)量分數(shù)測定作為刺五加、五加皮、紅毛五加皮質(zhì)量比較的指標。方法學考察表明本方法簡便、穩(wěn)定、重復性好。

本試驗6批刺五加、3批五加皮和3批紅毛五加皮中3種成分的質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果表明，刺五加中紫丁香苷、綠原酸質(zhì)量分數(shù)最高，其中紫丁香苷質(zhì)量分數(shù)約為五加皮、紅毛五加皮中的7～25倍，綠原酸質(zhì)量分數(shù)約為五加皮、紅毛五加皮中的3～5倍；而五加皮中原兒茶酸質(zhì)量分數(shù)最高，其次為紅毛五加皮、刺五加。各有效成分質(zhì)量分數(shù)的高低對3種藥材的藥理作用有較大影響，故3種藥材在臨床上具有不同的功效作用，用于相應的病癥。

刺五加主要用于治療脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多夢等癥，五加皮主要用于風濕痹病、筋骨痿軟、行遲、水腫、腳氣，兩者功效完全不同。紅毛五加皮(川加皮)功效與五加皮功效大致相同，但沒有利水消腫的功效，與后者不能混用，更不能認為它就是刺五加。本方法可以準確鑒別刺五加，并與五加皮、紅毛五加皮相區(qū)別。3種活性成分質(zhì)量分數(shù)的差異可為3種藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)，亦為臨床用藥的指導提供試驗參考。

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(責任編輯:劉曉涵)

Determination of three constituents in Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex by HPLC

REN Jin1，LIAO Xian2，XIE Zhenshan1，YE Jiahong1，HUANG Yuechun2
(1.First School of Clinic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.The first Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

ObjectiveTo establish a determintation method for protocatechuic acid，syringing and chlorogenic acid in Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex by HPLC.MethodsHPLC method was performed with the Kromasil C18column.The acetonitrile-0.1%phosphoric acid(gradient elution)was employed as a mobile phase，and the detection wavelength was 270 nm.Column temperature was 30℃，and the flow rate was 1.0 mL/min.ResultsBaseline separation was obtained and the linear relationship was good(r≥0.999 9)for the three constituents.The average recoveries of protocatechuic acid，syringin，and chlorogenic acid were 98.7%，99.7%and 101.0%，and their RSD were below 3.0%(n＝6).In Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex，the content of protocatechuic acid was 0.022 5－0.028 7，0.076 3－0.132，0.013 8－0.071 2 mg/g，and the content of syringin was 0.445－0.616，0.023 8－0.025 9，0.037 3－0.069 3 mg/g，and that of chlorogenic acid was 1.834－2.169，0.659－0.713，0.372－0.709 mg/g，respectively.The contents of syringin and chlorogenic acid in Acanthopanax senticosiRadix et Rhizoma seu Caulis were the highest，in which that of syringin was as about 7－25 times high as canthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex while that of chlorogenic was as 3－5 times.The content of protocatechuic acid in Acanthopanacis Cortex was the highest，followed by Acanthopanax giraldii Cortex and Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis.ConclusionThe method is sensitive，reliable and available for the quality control of Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex.

Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis；Acanthopanacis Cortex；Acanthopanax giraldii Cortex；protocatechuic acid；syringin；chlorogenic acid；HPLC

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.010

1006-8783(2015)05-0602-05

2015-06-15

任晉(1990—)，男，2013級碩士研究生，Email:18620163890＠163.com；通信作者:黃月純(1968—)，女，主任中藥師，碩士生導師，從事中藥質(zhì)量標準研究與指紋圖譜分析，Email:huangyuechun＠163.com。

時間:2015-10-19 15:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151019.1505.004.html