黎丹，白吉慶，王小平，胡錦蘋(píng)，王金，王芳

狼牙刺種子總生物堿提取工藝優(yōu)化

黎丹，白吉慶，王小平，胡錦蘋(píng)，王金，王芳

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046)

目的優(yōu)化狼牙刺種子總生物堿的提取工藝。方法采用正交試驗(yàn)方法考察提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)狼牙刺種子總生物堿的提取率的影響，優(yōu)選狼牙刺種子總生物堿較佳提取工藝。結(jié)果優(yōu)選得到的狼牙刺種子總生物堿最佳提取工藝為:提取時(shí)間2 h，料液比1∶15(g∶mL)，提取次數(shù)為2次。按優(yōu)化條件提取狼牙刺種子總生物堿的提取率為48.71 mg/g。結(jié)論優(yōu)選得到的工藝穩(wěn)定、可行，提取得到狼牙刺種子總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高。

狼牙刺；種子；生物堿；正交試驗(yàn)

狼牙刺(Sophora viciifolia Hance)又名白刺花，為豆科槐屬多年生灌木，分布于我國(guó)的河北、陜西、山西、河南、甘肅、四川、貴州等省，多生于海拔1 000 ～1 500 m的陽(yáng)坡或河谷地帶[1-2]，具有清熱燥濕、涼血解毒、利濕消腫的功效，主要用于咽喉腫痛、熱癥出血、癰腫療毒等[1]。狼牙刺含有苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿等多種生物堿[3-4]。文獻(xiàn)報(bào)道此類(lèi)生物堿具有殺蟲(chóng)抑菌、抗感染、抗心律不齊、抗腫瘤等多種活性[5-9]。目前，狼牙刺種子的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在生物堿類(lèi)成分的含量測(cè)定[2-4]，尚未見(jiàn)其總生物堿提取工藝的報(bào)道。為了考察狼牙刺種子總生物堿提取的最佳條件，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)狼牙刺種子生物堿主要集中在親水性較強(qiáng)部位，因此本文采用水提工藝，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化狼牙刺種子總生物堿的水提工藝。

1 儀器與試劑

BT125D型雙量程電子分析天平(賽多利斯股份有限公司)；UV-6100紫外可見(jiàn)分光光度儀(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；Direct-Q 3UV純化水機(jī)(默克密理博)。狼牙刺種子經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶副教授鑒定為狼牙刺(Sophora viciifolia Hance)的種子；苦參堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110805-200508)；溴百里香草酚藍(lán)、三氯甲烷、甲醇均為分析純，水為純化水。

2 方法

2.1 提取方法

選取提取時(shí)間(h)、料液比(g∶mL)、提取次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以總生物堿的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化最佳提取工藝條件。正交試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

2.2 總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定[10]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品1.0 mg，置10 mL的容量瓶中，加無(wú)水甲醇溶解，定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 酸性染料緩沖溶液的制備 緩沖溶液的配制:取KH2PO427.22 g，加水溶解并稀釋成1 000 mL，取50 mL，加0.2 mol/L NaOH溶液42.4 mL，再加水稀釋至200 mL，即得[11]。

溴麝香草酚藍(lán)緩沖溶液(pH7.6)的配制:精密稱(chēng)取溴百里香草酚藍(lán)0.025 g，加入上述緩沖溶液200 mL，搖勻，即得。

2.2.3 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別精密移取上述對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置10 mL具塞試管中，分別加入溴麝香草酚藍(lán)緩沖溶液3 mL，搖勻，再加入三氯甲烷5 mL，密塞，振搖2 min，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，靜置30 min，分取三氯甲烷層，以相應(yīng)的試劑為空白，在413 nm處測(cè)定吸光度，以苦參堿對(duì)照品的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程A＝0.055 1ρ＋0.003 9，r＝0.999 6(n＝5)，苦參堿對(duì)照品在1.00～10.03 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.4 樣品測(cè)定 分別取狼牙刺種子2 g，精密稱(chēng)定，置100 mL圓底燒瓶中，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，所得提取液即為供試品溶液。取以上供試品溶液適量，置10 mL具塞試管中，照“2.2.3”項(xiàng)下的方法，自“加入溴麝香草酚藍(lán)緩沖溶液3 mL”起同法操作，依法測(cè)定吸光度，并計(jì)算提取率，即得。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 取狼牙刺種子2 g共3份，精密稱(chēng)定，置100 mL圓底燒瓶中，加15倍量的水，回流提取2次，每次2 h，合并濾液作為提取液，按照“2.2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算總生物堿的提取率。

3 結(jié)果

3.1 提取工藝篩選結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。可見(jiàn)，影響總生物堿提取的主次因素為A＞C＞B，即提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞料液比，3個(gè)因素對(duì)狼牙刺種子總生物堿提取率的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況以及正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳提取工藝為A2B2C2，即提取時(shí)間為2 h，料液比(g∶mL) 為1∶15，提取次數(shù)為2次。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Results of variance analysis

3.2 驗(yàn)證結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)得到總生物堿提取量分別為48.24、48.76、49.14 mg/g，RSD值為0.93%，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

4.1 提取方法及溶劑的選擇

在預(yù)試驗(yàn)中用超聲、回流等方法提取狼牙刺種子總生物堿，結(jié)果回流法提取所得總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；因此本文采用回流提取法，分別對(duì)水、酸水、95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇、60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇幾種溶媒進(jìn)行考察，結(jié)果顯示95%乙醇提取液中，總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%鹽酸溶液和60%乙醇提取液中，總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大，為了經(jīng)濟(jì)與方便，最終選擇以水為提取溶媒進(jìn)行正交試驗(yàn)。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色，于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，兩者均在413 nm處有最大吸收，故選擇413 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

4.3 測(cè)定方法的選擇

總生物堿的測(cè)定方法主要有酸性染料比色法、雷氏鹽比色法和苦味酸鹽比色法，最常用的是酸性染料比色法，該法的關(guān)鍵是酸性染料、pH值和萃取有機(jī)溶劑的選擇；因此，本文對(duì)酸性染料的種類(lèi)進(jìn)行了選擇，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)溴麝香草酚藍(lán)最穩(wěn)定，重現(xiàn)性最好，最終選擇溴麝香草酚藍(lán)作為染料。同時(shí)，對(duì)緩沖液pH(pH 6.0～8.0)、酸性染料緩沖液體積(2、3、4、5、6 mL)、萃取劑三氯甲烷的用量(4、5、6、7 mL)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，溴麝香草酚藍(lán)pH＝7.6的緩沖溶液3 mL，三氯甲烷5 mL為最佳。4.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的分析可知，各因素對(duì)狼牙刺種子總生物堿的提取效果影響的主次順序?yàn)锳(提取時(shí)間)＞C(提取次數(shù))＞B(料液比)，方差分析結(jié)果表明3個(gè)因素的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中料液比的影響最小，可能是由于溶劑量的增加使其他成分的溶出率增大，從而影響生物堿的溶出，導(dǎo)致提取率變化不大。

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(責(zé)任編輯:陳翔)

Optimization of extraction technology of total alkaloids in the seeds of Sophora
viciifolia Hance

LI Dan，BAI Jiqing，WANG Xiaoping，HU Jinping，WANG Jin，WANG Fang
(School of Pharmacy Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

ObjectiveTo optimize the extraction process of total alkaloids in the seeds of Sophora viciifolia Hance.MethodsThe orthogonal test was designed to evaluate the effects of extraction solvent ratio，time and number of times on total alkaloids yield.ResultsThe optimum extraction process was as follows: extracting for 2 times，solid-liquid ratio 1∶15(g∶mL)，and 2 hours each time，the total alkaloids yield was 48.71 mg/g.ConclusionThis optimized technology was stable and feasible with high extraction rate.

the seeds of Sophora viciifolia Hance；total alkaloids；orthogonal design

R284.2

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.007

1006-8783(2015)05-0589-03

2015-07-13

陜西省科技廳資助項(xiàng)目(2014K14-01-01)；陜西省教育廳資助項(xiàng)目(2013JK0834)

黎丹(1989—)，女，2013級(jí)碩士研究生，Email:307819478＠qq.com；通信作者:王小平(1976—)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及新藥開(kāi)發(fā)研究，電話(huà):029-38185165，Email:wangxiaoping323＠126.com。

時(shí)間:2015-09-25 14:30

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1430.008.html