王強(qiáng)，李鐘，張維維，陳菊英，劉塔斯

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208)

玉竹多糖的硫酸酯化及其對(duì)HepG-2細(xì)胞體外抑制活性研究

王強(qiáng)1，李鐘1，張維維1，陳菊英1，劉塔斯2

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208)

目的對(duì)玉竹精制多糖進(jìn)行硫酸酯化，并分析其體外抗腫瘤活性的變化。方法采用三氧化硫-吡啶法對(duì)水溶性玉竹多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，紅外光譜分析光譜性質(zhì)的變化。采用HepG-2細(xì)胞對(duì)水溶性玉竹多糖及其硫酸酯的體外抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果玉竹中性多糖(POPZ80)取代度可達(dá)1.23，酸性多糖(POPS80)取代度可達(dá)0.26；水溶性玉竹多糖硫酸酯化后的體外抑制HepG-2活性明顯增強(qiáng)，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制率與用藥劑量呈正相關(guān)。結(jié)論玉竹精制多糖經(jīng)硫酸酯化后體外抗腫瘤活性增強(qiáng)。

玉竹精制多糖；多糖硫酸酯化；硫酸基取代度；HepG-2；體外抗腫瘤活性

玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum (Mill.)Druce的干燥根莖，味甘、微寒，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、生津止渴的功能[1]。玉竹多糖為玉竹的主要成分。研究表明，玉竹多糖對(duì)血壓、心率、血糖有調(diào)節(jié)作用[2]，對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)多糖進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿有揎椖軌蛱岣咴械幕钚曰蛘叽偈剐碌幕钚援a(chǎn)生[4]。例如，香菇多糖硫酸酯化后，其抗氧化、抗腫瘤、抗病毒能力明顯增強(qiáng)[5-8]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉竹的研究主要集中在玉竹粗多糖的藥理活性及一級(jí)結(jié)構(gòu)解析，在玉竹精制多糖乃至玉竹多糖硫酸酯化衍生物活性方面的研究報(bào)道不多，而多糖的衍生化研究是近期多糖研究的熱點(diǎn)。本研究期望通過(guò)硫酸酯化的方法獲得具有更高生物活性的水溶性玉竹多糖，為多糖的改性研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

玉竹由湖南新邵玉竹GAP基地提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉塔斯教授鑒定為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce；DEAE-52纖維素(上海恒信公司)；SephadexG-100(上海江萊生物科技有限公司)；大孔吸附樹(shù)脂AB-8(南開(kāi)大學(xué)化工廠)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物公司)；MTT、透析袋(Sigma)；三氧化硫吡啶復(fù)合物(阿拉丁)。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。HepG-2細(xì)胞(廣東藥學(xué)院生物活性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。

NICOLET 5700型紅外光譜儀(美國(guó)尼高力公司)；UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；ALpha1-2型真空冷凍干燥機(jī)(Chirst公司)；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)；BS-100A型自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏公司)。

2 方法

2.1 水溶性玉竹多糖的提取

將干燥的玉竹切片、粉碎，過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱取玉竹粉末，加入石油醚回流提取2次，每次2 h，除去玉竹中的脂溶性成分。濾過(guò)，將濾渣干燥。以水為溶媒，在料液比為1∶15(g∶mL)、溫度80℃、時(shí)間2 h的條件下回流提取2次，合并2次提取液，減壓濃縮[9]。

2.2 精制水溶性玉竹多糖的制備及理化性質(zhì)測(cè)定

水溶性玉竹多糖液經(jīng)AB-8樹(shù)脂靜態(tài)除色后減壓濃縮，采用酶法＋Sevage除蛋白。用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇分別醇沉到60%和80%，冷凍干燥，分別得到60%醇沉粗多糖(POP60)和80%醇沉粗多糖(POP80)。本文主要以POP80為原料，將 POP80分別過(guò)DEAE-52、SephadexG-100柱得玉竹精制多糖，冷凍干燥備用[10]。硫酸苯酚、I-KI[11]、考馬斯亮藍(lán)[12]、FeCl3[13]反應(yīng)測(cè)定精制多糖純度。

2.3 水溶性玉竹多糖的硫酸酯化

取精制多糖500 mg，加入到適量甲酰胺(已除水)中，攪拌溶解后加入適量的三氧化硫吡啶復(fù)合物，反應(yīng)過(guò)程中不斷充入N2。充分反應(yīng)后將反應(yīng)液移至冰水中，調(diào)節(jié)溶液pH至7～8之間。加入4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，密封放入4℃冰箱沉淀12 h，離心收集沉淀，加甲醇洗滌直至無(wú)吡啶氣味[14]。加少量去離子水溶解于透析袋中，先用自來(lái)水透析1～2 d，再用去離子水透析2 d，每天換3～4次水。將透析液濃縮后冷凍干燥，得硫酸酯化多糖。

2.4 硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定及取代度計(jì)算

采用BaSO4濁度法測(cè)定硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以Na2SO4為標(biāo)準(zhǔn)物繪制硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。精確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的Na2SO4固體，溶于去離子水中，配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取0～1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(按0.2 mL遞升，即分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL)置于比色管中，各管用去離子水補(bǔ)加至總體積8.0 mL，另加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的三氯乙酸1 mL和BaCl2-明膠試液1 mL，混合后在室溫下靜置15～20 min，以確保硫酸根離子和BaCl2中的鋇離子充分反應(yīng)，而且生成的BaSO4沉淀能夠均勻分散在石英比色皿中。于波長(zhǎng)360 nm下測(cè)定吸光度，得吸光度A1；另以同樣標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，唯以明膠試液代替BaCl2-明膠試液做對(duì)照，于波長(zhǎng)360 nm下測(cè)定吸光度，得吸光度A2，以A1－A2的值對(duì)硫酸根濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。按取代公式:DS＝1.62×S%/(32－1.02×S%)計(jì)算硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)，式中DS表示取代度，S%表示硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.5 紅外光譜分析

取玉竹多糖及多糖硫酸酯樣品2 mg，以KBr壓片，在4 000～400 cm－1區(qū)間掃描紅外吸收光譜。2.6 體外抗腫瘤試驗(yàn)

利用MTT法評(píng)價(jià)水溶性玉竹多糖硫酸酯化前后抑制人肝癌細(xì)胞HepG-2的活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG-2培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種時(shí)細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個(gè)/mL，將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于37℃、5%(φ)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，再加入用磷酸緩沖液稀釋成不同濃度的多糖液10 μL?？瞻讓?duì)照組加入等體積的PBS液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后用MTT法于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，按公式:抑制率＝(A對(duì)照組－A給藥組)/A對(duì)照組× 100%，計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。

3 結(jié)果與分析

3.1 水溶性玉竹多糖純化結(jié)果

POP80經(jīng)DEAE-52、SephadexG-100柱得到2種精制多糖，分別為中性多糖(POPZ80，neutral polysaccharide) 和 酸 性 多 糖 (POPS80，acid polysaccharide)，經(jīng)紫外分析、I-KI反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)，結(jié)果顯示多糖不含蛋白質(zhì)、淀粉、多酚類物質(zhì)。硫酸苯酚法測(cè)得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%。3.2 水溶性玉竹多糖硫酸酯化結(jié)果

硫酸基質(zhì)量在20～100 μg之間線線性關(guān)系良好，回歸方程為:y＝0.012 5x－0.121 2，R2＝0.999 1。多糖能獲得最高的取代度(1.23)。

3.3 玉竹精制多糖及其硫酸酯的紅外光譜圖

玉竹酸性糖 POPS80與玉竹酸性糖硫酸酯POPSS80，玉竹中性多糖POPZ80與玉竹中性多糖硫酸酯POPZS80的紅外圖譜見(jiàn)圖1～圖2。

由圖 1～圖 2可知，POPZS80、POPSS80與POPZ80、POPS80紅外光譜有較明顯的差異，除了玉竹精制多糖特征吸收峰外，還增加了2個(gè)吸收峰: 1 260 cm－1左右處出現(xiàn)—OSO3—的S＝O拉伸振動(dòng)特征吸收峰，812 cm－1左右處出現(xiàn)C—O—S的拉伸振動(dòng)特征吸收峰，以上2組吸收峰表明分子內(nèi)存在硫酸基(—O—SO3)。由以上分析可以初步鑒定水溶性玉竹多糖成功硫酸酯化[16]。

圖1 玉竹酸性糖POPS80與玉竹酸性糖硫酸酯POPSS80的紅外光譜Figure 1 The IR spectrum of POPS80 and POPSS80

圖2 玉竹中性糖POPZ80與玉竹中性糖硫酸酯POPZS80的紅外光譜Figure 2 The IR spectrum of POPZ80 and POPZS80

3.4 體外抗腫瘤試驗(yàn)

不同濃度水溶性玉竹多糖及其硫酸酯(其中POPZ80、POPS80取代度分別為1.23，0.26)對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用見(jiàn)圖3～圖4。

圖3 POPZ80與POPZS80對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制率Figure 3 The Inhibition rate of POPZ80 and POPZS80 on the growth of HepG-2 cells in vitro

由圖3可知，POPZ80對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞無(wú)抑制作用，POPZS80對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞的抑制率可達(dá)44.3%；由圖 4可知，POPS80未硫酸酯化前已對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，在用藥劑量增加到400 μg/L時(shí)，抑制率可達(dá)55%，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，表明經(jīng)過(guò)硫酸酯化后，玉竹多糖的體外抗腫瘤活性明顯提高。

4 討論

本文采用三氧化硫-吡啶法對(duì)水溶性玉竹多糖進(jìn)行硫酸酯化，此方法操作安全、簡(jiǎn)便。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然提高反應(yīng)溫度、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間能夠增加多糖硫酸取代度，但同時(shí)多糖降解也很?chē)?yán)重，且多糖硫酸酯得率并不高。通過(guò)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，POPS80對(duì)HepG-2有體外抑制活性，而POPZ80對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，這可能與多糖分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)組成有關(guān)。二者硫酸酯化后對(duì)HepG-2細(xì)胞有明顯的抑制作用，且有明顯的濃度依賴關(guān)系，這可能是由于玉竹多糖糖單位的羥基被硫酸基基團(tuán)取代后，糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生扭曲或轉(zhuǎn)變，容易形成非共價(jià)鍵，而且這些陰離子基團(tuán)間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長(zhǎng)，部分硫酸基有可能和糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，因而在糖鏈局部形成螺旋結(jié)構(gòu)，呈有活性的高級(jí)構(gòu)象，且有序性增大，從而增強(qiáng)多糖的活性[16]。

對(duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是為了獲得活性更大的多糖及多糖衍生物，目前本研究只做了一種硫酸取代度下不同玉竹多糖硫酸酯體外抗腫瘤活性，而玉竹多糖硫酸酯活性與硫酸基團(tuán)取代度之間關(guān)系，硫酸基團(tuán)引入后玉竹多糖的空間結(jié)構(gòu)變化如何導(dǎo)致生物活性改變還有待進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯:陳翔)

Sulfated modification of water-soluble Polygonatum odoratum polysaccharides and its inhibiting effect on growth of HepG-2 cells in vitro

WANG Qiang1，LI Zhong1，ZHANG Weiwei1，CHEN Juyin1，LIU Tasi2
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhuo 510006，China；2.School of Pharmacy，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China)

ObjectiveTo sulfate refined polysaccharide extracted from Polygonatum odoratum and analysis the change in its anti-tumor activity in vitro.MethodsWater-soluble polysaccharide isolated from Polygonatum odoratum were chemically modified by using sulfur trioxide-pyridine.The changes in spectral properties of sulfated polysaccharide were analyzed by FT-IR spectroscopy.The HepG-2 cells were used to evaluate the in vitro anti-tumor activity of polygonatum polysaccharide and sulfated polysaccharide.ResultsThe degree of sulfation of POPZ80(neutral polysaccharide)and POPS80(acid polysaccharide)could reach 1.23 and 0.26.The sulfated derivatives could significantly inhibit the growth of HepG-2 cells.The inhibition rate was positively correlated with the concentration in the certain concentration range.ConclusionThe in vitro antitumor activity of refined Polygonatum odoratum polysaccharide was enhanced after sulfated modification.

Refined Polygonatum odoratum polysaccharide；sulfation of polysaccharide；degrees of sulfation；HepG-2；in vitro antitumor activity

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.006

1006-8783(2015)05-0585-04

2015-07-27

國(guó)家科技部支撐計(jì)劃項(xiàng)目(SQ2010BAJY1411-09)

王強(qiáng)(1990—)，男，2013級(jí)碩士研究生；通信作者:李鐘(1973—)，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量與資源的研究，Email:lizhongi＠126.com。

時(shí)間:2015-10-09 15:34

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151009.1534.002.html