關(guān)石鳳，管淑玉，李洋，陳典，曾宇，陳超

三棱抗氧化提取物提取工藝優(yōu)化研究

關(guān)石鳳1，2，管淑玉1，3，4，李洋1，陳典1，曾宇1，3，4，陳超1，3，4

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學(xué)院 附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510080；3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東廣州510006；4.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)

目的優(yōu)化三棱抗氧化有效成分提取工藝。方法以三棱提取物對(duì)1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)清除率為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比為考察因素，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化三棱的提取工藝。結(jié)果響應(yīng)面分析法得出三棱抗氧化有效成分的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%，液料比為20∶1(mL∶g)，提取時(shí)間為1 h，提取2次。在此條件下三棱清除率為57.28%，與理論值56.59%基本相符。結(jié)論通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化三棱抗氧化物質(zhì)提取工藝條件簡(jiǎn)單可行，可用于三棱中抗氧化有效成分的提取。

三棱；抗氧化；響應(yīng)面分析法；提取工藝優(yōu)化

三棱系黑三棱科植物黑三棱 Sparganium stoloniferumBuch.-Ham削去外皮的干燥塊莖，味苦、性平，入肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛等功效，是活血化瘀的常用中藥[1]，臨床多用醋制品。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，醋三棱提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性，本研究通過響應(yīng)面分析法優(yōu)選三棱抗氧化活性成分的提取工藝，為三棱藥材資源的開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

醋三棱藥材(批號(hào):141001)購(gòu)于廣東致信中藥飲片有限公司，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為黑三棱科黑三棱Sparganium stoloniferum Buch-Ham干燥塊莖醋制品，符合《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定；95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇(天津百世化工有限公司，分析純，批號(hào):20130928)；鹽酸(廣州市東紅化工廠，分析純，批號(hào):20100320)；1，1-二苯基-2-苦肼基[DPPH，阿拉丁試劑(上海)有限公司，分析純，批號(hào):K1319045]；水為超純水。

UV2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；HH-4恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；FA10048B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材與試劑的前處理

2.1.1 三棱藥材的處理 稱取三棱藥材粗粉1 g，乙醇回流提取2 h，濾過，備用。

2.1.2 0.1 mmol/L DPPH溶液的配制 精密稱定DPPH 3.94 mg，加95%乙醇使溶解，并用95%乙醇定容至100 mL量瓶中，置于冰箱，備用。

2.2 DPPH自由基的清除試驗(yàn)

分別量取各提取液2 mL于試管中，分別加入DPPH溶液2 mL，搖勻，置于陰暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度值，記為Ai；再分別量取提取液2 mL，分別加入95%乙醇2 mL，搖勻，置暗處30 min測(cè)吸光度值，記為Aj；再分別量取95%乙醇2 mL，分別加入DPPH溶液2 mL，搖勻，置暗處30 min后測(cè)吸光度值，記為A0。按以下公式計(jì)算清除率:清除率＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間為響應(yīng)變量，試驗(yàn)的因素與水平見表1，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立三因素三水平數(shù)學(xué)模型[2]，以DPPH清除率(Y)為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到DPPH清除率(Y)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型:Y＝49.53－2.76A＋7.19B＋11.08C＋7.20AB－9.93AC－3.29BC－9.06A2－1.33B2－13.66C2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The design and test results of the response surface method

由表3可知，回歸模型的P＜0.01，表明該模型整體達(dá)到高度顯著水平，即用該回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因變量與全體自變量之間的關(guān)系是顯著的，說明該方法是可靠的。失擬項(xiàng)P＝0.065 7＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明無失擬因素存在，因此可以用該模型分析和預(yù)測(cè)三棱抗氧化有效成分提取。各因素中一次項(xiàng)A(乙醇體積分?jǐn)?shù))和二次項(xiàng)A2對(duì)抗氧化成分的提取影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，一次項(xiàng)C(液料比)和二次項(xiàng)AB、B2對(duì)抗氧化成分的提取影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而B、AC、BC、C2對(duì)抗氧化成分的提取影響差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明各影響因素與抗氧化成分提取率之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。此外，從P值可看出各因素對(duì)三棱抗氧化提取物提取率的影響從大到小排列次序?yàn)锳＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時(shí)間。

表3 響應(yīng)面分析擬合回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of fit regression model by response surface

響應(yīng)面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱趨勢(shì)，如果響應(yīng)面坡度相對(duì)較平緩，表示可以忍受處理?xiàng)l件的變異，而不影響響應(yīng)值大小；相反，如果坡度非常陡峭，表明處理?xiàng)l件的變異對(duì)響應(yīng)值的影響非常大，即響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[3]。如果等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[4]。為確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間3個(gè)因素和交互作用對(duì)三棱抗氧化提取物清除率的影響，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間3個(gè)因素中任意一個(gè)變量為0，分別考察其余2個(gè)變量對(duì)三棱抗氧化提取物清除率的影響，結(jié)果見圖1～圖3?？梢?，3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)三棱抗氧化活性成分的清除率的影響均不顯著，表現(xiàn)為曲線較平滑，與方差分析結(jié)果相一致。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)清除率影響的響應(yīng)面和等高線Figure 1 The response surface and contour of ethanol volume fraction and the ratio of feed to liquid on the removal rate

圖2 提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)清除率影響的響應(yīng)面和等高線Figure 2 The response surface and contour of the extraction time and ethanol volume fraction on the removal rate

圖3 液料比和提取時(shí)間對(duì)清除率影響的響應(yīng)面和等高線Figure 3 The response surface and contour of the ratio of material to liquid and extraction time on the removal rate

2.4 最佳提取工藝及驗(yàn)證

通過Design Expert 8.05b軟件得到的三棱抗氧化最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)72.44%，液料比20∶1(mL∶g)，提取時(shí)間為1.06 h，提取2次，清除率理論值為56.59%，考慮實(shí)際操作方便性，選擇最佳提取工藝參數(shù):乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%，液料比為20∶1 (mL∶g)，提取時(shí)間為1 h，提取2次。按最佳工藝進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到DPPH自由基平均清除率為57.28%，與Design Expert 8.05b軟件得到的理論值相比，相對(duì)誤差為1.21%，表明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多數(shù)活血化瘀藥如紅花、丹參等均具有抗氧化活性。紅花具有一定的清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，尤其對(duì)羥自由基的清除效果很好，清除率達(dá)98.31%[5]。丹參中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B均有較好清除超氧陰離子活性[6]。三棱是常用的活血化瘀藥，其抗氧化活性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究首次發(fā)現(xiàn)三棱的抗氧化活性，為尋找高效、低毒的抗氧化新藥及天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

響應(yīng)面法的優(yōu)點(diǎn)是在試驗(yàn)條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，所以響應(yīng)面法被廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)與工藝優(yōu)化研究[7]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取三棱抗氧化活性成分影響最主要的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，最佳提取工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%，而提取黑三棱中黃酮類化合物的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)66%[8]，據(jù)此推斷，三棱抗氧化活性可能與三棱中黃酮類化合物有關(guān)，具體成分有待進(jìn)一步研究。

[1]戴仕林，吳啟南，殷婕.中藥三棱的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2011，17(1):63-64.

[2]侯淑珍，王景媛，王娜，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛蒡根多糖提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(11): 21.

[3]陳莉，屠康，王海，等.采用響應(yīng)面法對(duì)采后紅富士蘋果熱處理?xiàng)l件的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(2): 159-163.

[4]徐媛，王魯峰，徐曉云，等.響應(yīng)面法優(yōu)化紅葡萄柚番茄紅素的提取工藝[J].食品科學(xué)，2010，31(22):255-259.

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[7]徐秀泉，虞倩，徐穎.趕黃草總黃酮超聲提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化及其體外抗氧化活性分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(18):38.

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(責(zé)任編輯:陳翔)

Study on optimization of extraction process of Rhizoma Sparganii antioxidative components

GUAN Shifeng1，2，GUAN Shuyu1，3，4，LI Yang1，CHEN Dian1，ZENG Yu1，3，4，CHEN Chao1，3，4
(1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmacutical University，Guangzhou 510006，China；2.The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmacutical University，Guangzhou 510080，China；3.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；4.Engineering＆Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo optimize the extraction process of Rhizoma Sparganii antioxidant components was optimized by using Rhizoma Sparganii as raw materials.MethodsRhizoma Sparganii extractive on DPPH scavenging rate as response value，response surface methodology was used to optimize the extraction process by using volume fraction of ethanol，extraction time，liquid-solid ratio as factors.ResultsThe optimum conditions were as follows:the volume fraction ethanol 72%，liquid-solid ratio 20∶1(mL∶g)，extraction duration 1 h and extracting times twice.The Rhizoma Sparganii clearance rate was 57.28%，which was roughly in line with the theoretical value of 56.59%.ConclusionIt is simple and feasible to optimize the extraction of active ingredients of Rhizoma Sparganii antioxidant by using the response surface methodology，which can be used to extract the active ingredients of Rhizoma Sparganii antioxidant.

Rhizoma Sparganii；antioxidant； response surface methodology； extraction process optimization

R284.2

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.005

1006-8783(2015)05-0581-04

2015-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81001702)；廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)項(xiàng)目(201508020016)

關(guān)石鳳(1985—)，女，2012級(jí)在職碩士研究生，從事中藥質(zhì)量控制研究，Email:fengguan063＠163.com；通信作者:管淑玉(1976—)，女，博士，副教授，從事中藥質(zhì)量控制與生物活性研究，Email:guanshy3＠163.com。

時(shí)間:2015-09-25 14:20

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150925.1420.004.html