寧婷，李月，徐翀

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧沈陽(yáng)110001)

紫杉醇-漢防己甲素復(fù)合納米粒的制備及其逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥的研究

寧婷，李月，徐翀

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧沈陽(yáng)110001)

目的制備載有紫杉醇和漢防己甲素的復(fù)合納米粒，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性研究。方法采用納米沉淀法制備紫杉醇-漢防己甲素復(fù)合納米粒，對(duì)其載藥量、包封率、粒徑進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其體外釋放行為進(jìn)行考察。采用體外細(xì)胞毒試驗(yàn)和Western blot法考察復(fù)合納米粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果。結(jié)果復(fù)合納米粒的紫杉醇和漢防己甲素載藥量分別為0.49%和0.20%，包封率分別為98.3%和99.6%，粒徑為(107.3±15.6)nm。體外釋放試驗(yàn)表明，紫杉醇和漢防己甲素幾乎同步釋放。MCF7/ADR細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于游離紫杉醇，紫杉醇-漢防己甲素復(fù)合納米粒的IC50從6.7 μmol/L降為1.1 μmol/L。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明漢防己甲素有效地抑制了P-gp的表達(dá)。結(jié)論中藥漢防己甲素能夠有效地改善紫杉醇對(duì)耐藥細(xì)胞株的耐藥性。

紫杉醇；漢防己甲素；納米粒；多藥耐藥性

癌癥治療目前的主要方法是化療，化療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)常常導(dǎo)致達(dá)不到預(yù)期的化療效果。導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR現(xiàn)象的機(jī)制很多，其中由MDR-1編碼的P-糖蛋白(P-gp)過表達(dá)是目前公認(rèn)的主要的耐藥機(jī)制[1-2]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是臨床上應(yīng)用廣泛的一線抗癌藥物，在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等的治療中均有應(yīng)用，PTX對(duì)敏感腫瘤具有良好的抗腫瘤效果，但隨著MDR的出現(xiàn)，PTX的抗腫瘤效果大打折扣；因此，如何逆轉(zhuǎn)MDR成為PTX臨床應(yīng)用急需解決的關(guān)鍵問題。

漢防己甲素(tetrandrine，TET)是從防己科植物塊根中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、化療增敏及顯著逆轉(zhuǎn)MDR活性的作用[3-6]。聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的可用于人體的生物可降解材料，近年來被廣泛用于組織工程及藥物載體研究中。本文采用PLGA同時(shí)包載PTX和TET，以期逆轉(zhuǎn)PTX 的MDR，增加其臨床療效，采用納米沉淀法制備雙載藥PTX/TET PLGA納米粒，測(cè)定其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等，并對(duì)其體外釋放行為以及逆轉(zhuǎn)MDR的性能進(jìn)行考察。

1 材料與方法

1.1 試劑

紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.5%，武漢賽創(chuàng)科技有限責(zé)任公司)；漢防己甲素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.0%，貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司)；RPMI Medium 1640(美國(guó)Gibco BRL公司)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(質(zhì)量比50∶50，相對(duì)分子質(zhì)量90 000，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；維生素 E聚乙二醇琥珀酸酯(D-alphatocohperyl polyethylene glycol succinate，TPGS，武漢國(guó)邦達(dá)醫(yī)藥化工股份有限公司)；小牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)；TRIzoL(Molecular Reseach Center公司)；SDS-PAGE次高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；Western blot試劑盒(Protein DetectorTMWestern Blot kit BCIP/NBT System，KPL公司)；P-gp兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；抗 β-actin兔多克隆抗體(美國(guó) Abgent公司)；二抗辣根過氧化氫酶(HRP)標(biāo)記的驢抗兔IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)；化學(xué)發(fā)光底物(ECL，美國(guó)Pierce公司)。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)

MCF7/ADR細(xì)胞是具有MDR1表型的耐藥細(xì)胞系，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供。細(xì)胞接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.3 載藥納米粒的制備

采用納米沉淀法制備雙載藥PTX/TET PLGA納米粒:將一定量的PTX(和)或TET與PLGA用乙醇溶解，配制成PTX質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的乙醇溶液，移液槍移取20 μL，在攪拌過程中緩慢注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的TPGS水溶液中，持續(xù)攪拌2 h，除去乙醇，即得載藥納米溶液。

空白PLGA納米粒同此法操作即得。

1.4 納米粒的表征

吸取少量PTX/TET PLGA納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的pH 6.2磷鎢酸溶液負(fù)染，自然晾干后，于透射電子顯微鏡(JEOL 1230)下觀察納米粒形態(tài)和粒徑。取納米粒混懸液適量，加10 mmol/L NaCl稀釋后用Zetasizer Nano system粒徑分析儀測(cè)定粒子粒徑。

1.5 載藥量和包封率的測(cè)定

將PTX/TET PLGA納米?；鞈乙? 000 r/min離心5 min，移液槍吸取上清液10 μL，加入乙腈90 μL，渦旋溶解，參考文獻(xiàn)[7-8]方法，采用日本島津的LC10AT高效液相色譜儀(HPLC)分別在 227、282 nm波長(zhǎng)處測(cè)定PTX和TET的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

色譜條件:色譜柱為大連依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μmol/L)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，分離PTX和TET的流動(dòng)相分別為乙腈-水(體積比35∶65)和甲醇-乙醚-三乙胺(體積比100∶1∶0.05)。按照以下公式計(jì)算包封率和載藥量[9]:

包封率(EE)＝[上清液中PTX(TET)的量]/[加入的PTX(TET)的總量]×100%，

載藥量(LE)＝[上清液中PTX(TET)的量]/[上清液中PTX(TET)的量＋PLGA的量]×100%。1.6 體外釋放試驗(yàn)

[10]方法:pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%十二烷基硫酸鈉)作為釋放介質(zhì)，吸取PTX/TET PLGA納米粒溶液5.0 mL于透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500)中，并將透析袋置于250 mL的釋放介質(zhì)中，于(37±0.5)℃、100 r/min條件下進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)。定時(shí)取樣2 mL，并適時(shí)補(bǔ)充2 mL新鮮介質(zhì)，平行測(cè)定3次。

1.7 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[11]

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7/ADR細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為7 000～8 000個(gè)。將細(xì)胞板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同藥物濃度(0.01～12.5 μmol/L)的PTX、TET、PLGA空白納米粒、雙載藥PTX/TET PLGA納米粒、PTX與TET的混合物，培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，加入DMSO溶液150 μL，然后放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處的吸光度，記錄結(jié)果，每組重復(fù)3次，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.8 蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)[9]

1.8.1 細(xì)胞總蛋白提取及蛋白含量的測(cè)定 將MCF7/ADR接種到100 mm的培養(yǎng)皿中，采用不同載藥納米粒分別處理，48 h后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞。離心濃縮各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS溶液漂洗細(xì)胞2次，離心棄上清后，加入預(yù)冷至0℃的裂解緩沖液1 mL，充分混勻后移入Eppendorf管中，0℃放置30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，保存蛋白樣品于－20℃。BCA法測(cè)定所抽提蛋白濃度。電泳及轉(zhuǎn)移:每道20 μL蛋白樣品，加入等量2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min后上樣，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS PAGE電泳(85 V)3 h分離蛋白后，以恒流0.9～1 mA/cm2(硝酸纖維素膜)半干電轉(zhuǎn)移2 h。1.8.2 Western blot方法 轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗P-gp(1∶200)4℃孵育過夜，之后用1×PBST洗3次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的驢抗兔多克隆二抗(1∶5 000)室溫振搖孵育1 h，用1×PBST洗滌4次除去未結(jié)合的二抗，用ECL試劑盒曝光顯影。內(nèi)參選用β-actin。

2 結(jié)果

2.1 納米粒的制劑學(xué)性質(zhì)

通過調(diào)節(jié)PTX、TET與PLGA的比例，考察不同載藥量及載藥比納米粒的包封率和載藥量，結(jié)果見表1。可見，隨著藥物與PLGA質(zhì)量比的增加，PTX/ TET PLGA納米粒的載藥量和包封率都有下降趨勢(shì)；固定處方中PTX與PLGA的比例，調(diào)節(jié)TET的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著TET的增加，PTX與TET在PLGA納米粒中的載藥量和包封率均有下降趨勢(shì)；因此，選取處方3進(jìn)行后續(xù)研究，其典型透射電鏡圖見圖1，動(dòng)態(tài)光散射粒徑測(cè)定結(jié)果見圖2，平均粒徑為(107.3±15.6)nm(n＝3)。

表1 PTX和TET與PLGA的比例對(duì)雙載藥納米粒的載藥量和包封率的影響(n＝3)Table 1 The effects of the ratios between PLGA and PTX and TET on the drug loading and the encapsulation efficiency

圖1 PTX/TET PLGA納米粒的透射電子顯微鏡圖Figure 1 The transmission electron microscopy of PTX/TET PLGA nanoparticles

圖2 PTX/TET PLGA納米粒的動(dòng)態(tài)光散射粒徑Figure 2 The DLS particle size of PTX/TET PLGA nanoparticles

2.2 體外釋放試驗(yàn)

體外釋放結(jié)果(見圖3)表明，PTX/TET PLGA納米粒PTX和TET的釋放均較緩慢，在12 h的累積釋放率分別為26.0%和23.3%，72 h的累積釋放率分別為58.2%和53.0%，二者釋放基本同步，這將保證雙載藥PTX/TET PLGA納米粒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)同時(shí)釋放藥物，以有效的產(chǎn)生協(xié)同作用。

圖3 PTX/TET PLGA納米粒的釋放曲線Figure 3 The release profiles of PTX/TET PLGA nanoparticles

2.3 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

從圖4可見，空白PLGA納米粒對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞幾乎沒有抑制作用，TET的抑制作用也較弱，PTX/TET PLGA納米粒呈現(xiàn)最強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞抑制作用。根據(jù)抑制率和濃度的關(guān)系，采用IC50計(jì)算軟件計(jì)算藥物的IC50值，PTX、PTX與TET的混合物、雙載藥PTX/TET PLGA納米粒作用于MCF7/ADR細(xì)胞48 h后的 IC50值計(jì)算結(jié)果分別為6.7、2.7、1.1 μmol/L，表明TET顯著提高了PTX的體外抗腫瘤活性。

圖4 各藥物作用于MCF7/ADR細(xì)胞48 h后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況Figure 4 The cytotoxicities of the drugs against MCF7/ADR cells after 48 h incubation

2.4 TET對(duì)P-gp的影響

據(jù)文獻(xiàn)[12-14]報(bào)道，TET可通過抑制P-gp產(chǎn)生克服MDR的作用；因此，本文分別對(duì)PTX、TET、PTX與TET的混合物、以及雙載藥納米粒對(duì)P-gp的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，PTX給藥輕微上調(diào)了P-gp的表達(dá)量，而TET的加入能顯著下調(diào)MCF7/ADR細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，納米粒復(fù)合給藥后，對(duì)P-gp表達(dá)的抑制作用更明顯，這也是雙載藥納米粒細(xì)胞毒性顯著強(qiáng)于單獨(dú)游離藥物細(xì)胞毒性的原因之一。

圖5 不同藥物對(duì)MCF-7/ADR中P-gp表達(dá)的影響Figure 5 Effects of MCF-7/ADR cells on P-gp expression of various kinds of formulations

3 討論

目前，研究耐藥的相關(guān)機(jī)制和尋找有效逆轉(zhuǎn)MDR已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。研究表明，P-gp的過表達(dá)是產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一[1-2]。關(guān)于P-gp抑制劑的研究很多，但所報(bào)道的抑制劑大多會(huì)產(chǎn)生不良作用。中藥作為P-gp抑制劑較其他化學(xué)抑制劑有很多優(yōu)點(diǎn):作用靶點(diǎn)多，具有一定的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，具有化療增敏作用等[15-16]。這其中，TET逆轉(zhuǎn)MDR的作用逐漸引起重視[13]。本文結(jié)果表明，通過有效抑制P-gp的表達(dá)，雙載藥PTX/TET PLGA納米粒對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞的殺傷力顯著高于其他對(duì)照組。

在細(xì)胞毒以及對(duì)P-gp抑制作用的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PTX/TET復(fù)合納米粒的作用效果均比PTX、TET單獨(dú)給藥或者混合給藥要好，這可能是由于藥物單獨(dú)給藥時(shí)，由于藥物溶解度小，導(dǎo)致在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中形成沉淀析出，從而導(dǎo)致細(xì)胞攝取量減少；而復(fù)合納米粒給藥時(shí)，藥物包封在納米載體中，可通過內(nèi)吞作用攝取進(jìn)入細(xì)胞中。

另外，本文結(jié)果表明，采用PLGA裝載PTX和TET具有良好的同步緩釋性能，這為兩藥協(xié)同作用的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)，但是藥物的體外行為并不能完全反映其體內(nèi)行為，還需要進(jìn)一步對(duì)其藥動(dòng)學(xué)和體內(nèi)藥效學(xué)進(jìn)行研究。

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(責(zé)任編輯:陳翔)

The preparation of paclitaxel-tetrandrine combined nanoparticles and its effect on overcoming multidrug resistance of MCF-7/ADR cells

NING Ting，LI Yue，XU Chong
(Department of Pharmacy，The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China)

ObjectiveTo prepare combined nanoparticles loading paclitaxel and tetrandrine and study its effect on overcoming multidrug resistance of tumor cells.MethodsThe combined nanoparticles were prepared using nano-precipitation methods.The drug loading，encapsulation efficiency and particle size were determined，and the release behavior in vitro was investigated.The effect of overcoming multidrug resistance was studied using MTT assay and Western blot assay.ResultsThe loading efficiency of the combined nanoparticles for paclitaxel and tetrandrine were 0.49%and 0.20%，respectively.The encapsulation efficiency of the combined nanoparticles for paclitaxel and tetrandrine were 98.3% and 99.6%，respectively.The mean particle size of prepared nanoparticles was(107.3±15.6)nm.In vitro release experiment showed that paclitaxel and tetrandrine were simultaneously released.Compared with free paclitaxel，the combined nanoparticles decreased IC50value from 6.7 μmol/L to 1.1 μmol/L.Western blot assay showed that the expression of P-gp was inhibited by tetrandrine.ConclusionsTraditional Chinese medicine tetrandrine could overcome the multidrug resistance of paclitaxel effectively.

paclitaxel；tetrandrine；nanoparticles；multidrug resistance

R944.9

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.002

1006-8783(2015)05-0566-05

2015-06-20

寧婷(1981—)，女，碩士，主管藥師，主要從事藥物新劑型的研究，電話:024-83282494，Email:nting1981＠163.com。

時(shí)間:2015-09-28 15:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150928.1522.006.html