許嚴(yán)偉,林海紅,杜鋼軍*

(1.洛陽市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽471002;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004)

棘霉素對(duì)伊馬替尼敏感及耐藥K562細(xì)胞ERK、AKT和SPK表達(dá)的影響

許嚴(yán)偉1,林海紅2,杜鋼軍2*

(1.洛陽市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽471002;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004)

目的比較棘霉素對(duì)伊馬替尼敏感及耐藥K562細(xì)胞ERK、AKT和SPK表達(dá)的影響。方法MTT法檢測細(xì)胞存活率,Western blot檢測ERK和AKT的表達(dá),同位素?fù)饺霗z測SPK的活性。結(jié)果棘霉素對(duì)K562和耐伊馬替尼細(xì)胞的IC50分別為0.82 mg/L和0.87 mg/L;棘霉素對(duì)ERK和AKT均有不同程度的抑制作用;耐藥K562細(xì)胞中SPK的表達(dá)遠(yuǎn)高于敏感細(xì)胞,且棘霉素對(duì)耐藥細(xì)胞中的SPK活性有顯著抑制作用。結(jié)論棘霉素對(duì)敏感及耐藥K562細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用,其機(jī)制與抑制ERK、AKT和SPK的作用有關(guān)。

棘霉素;K562;耐藥;ERK;AKT;SPK

甲磺酸―伊馬替尼(格列衛(wèi))是基于對(duì)癌細(xì)胞分子作用機(jī)理的了解而合理設(shè)計(jì)開發(fā)的第一個(gè)抗癌新藥,被譽(yù)為里程碑式的發(fā)現(xiàn)。作為首個(gè)上市的分子靶向治療藥物,開創(chuàng)了腫瘤分子靶向治療的新時(shí)代。伊馬替尼在挽救了無數(shù)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者的同時(shí),也贏得了無數(shù)的榮譽(yù)[1]。伊馬替尼自1999年開始進(jìn)入臨床試驗(yàn),對(duì)干擾素?zé)o效的慢性期CML患者,血液學(xué)完全緩解率可達(dá)100%,細(xì)胞遺傳學(xué)緩解率為53%,13%患者獲得完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解。然而,現(xiàn)在臨床發(fā)現(xiàn),應(yīng)用伊馬替尼雖然能夠使急變期的CML完全緩解,但大部分患者對(duì)伊馬替尼的應(yīng)答期較短,腫瘤細(xì)胞最終對(duì)其耐藥而使CML復(fù)發(fā)[]。

因此,開發(fā)與伊馬替尼作用機(jī)理不同,能克服腫瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼耐藥性的新型藥物成為當(dāng)前CML治療的迫切需要。我們實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)我國邊遠(yuǎn)地區(qū)土壤微生物的篩選,發(fā)現(xiàn)一株土壤放線菌提取物,經(jīng)過活性追蹤分離純化并鑒定其中的活性成分是蒽醌類抗生素―棘霉素(echinomycin)。K562細(xì)胞系來源于急變期CML患者,是研究CML經(jīng)典的細(xì)胞模型。我們選擇正常K562細(xì)胞及對(duì)伊馬替尼耐藥的K562細(xì)胞(K562/Ima)為靶細(xì)胞,初步觀察了棘霉素這兩種細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、蛋白激酶B通路(AKT)和鞘氨醇激酶(SPK)的表達(dá),為臨床克服伊馬替尼耐藥,尋找新的藥物提供佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株:K562細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所惠贈(zèng);K562耐伊馬替尼細(xì)胞K562/Ima由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所惠贈(zèng)。K562和K562/ Ima細(xì)胞均于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各10×105U/L的RPMI 1640,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

試劑與藥品:磷酸化和非磷酸化ERK1/2和AKT的抗體為Sant Cruz公司產(chǎn)品;(γ-32P)ATP購自北京福瑞生物工程公司;鞘氨醇、MTT、ATP購自Sigma公司;其他試劑皆為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

儀器:BIO-RAD垂直電泳儀,選自美國Bio-Rad公司。

1.2 MTT檢測

選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清培養(yǎng)基將細(xì)胞配成細(xì)胞濃度為(4～5)× 105個(gè)/m L的細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中180μL/孔,于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的棘霉素各20μL,使其終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L。另外,設(shè)對(duì)照組加入不同濃度的伊馬替尼, K562組其終濃度分別0.03、0.01、0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L。K562/Ima組分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、20.0 mg/L。各對(duì)照組加入20μL培養(yǎng)基,另設(shè)空白組,每組4個(gè)復(fù)孔。再培養(yǎng)48 h后,平板離心后除去上面培養(yǎng)基每孔加MTT質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 g/L的PBS(p H6.8)溶液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;每孔加DMSO 100μL,避光振蕩5 min,充分溶解后,于酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度值(OD值)。以加藥孔OD值與對(duì)照孔OD值的百分比為細(xì)胞存活率,根據(jù)細(xì)胞存活率和藥物濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系用SPSS軟件求藥物的IC50。

細(xì)胞的耐藥倍數(shù)計(jì)算方法:

耐藥倍數(shù)(RF)=耐藥細(xì)胞(IC50)/敏感細(xì)胞(IC50)

1.3 ERK、AKT蛋白檢測

K562和K562/Ima 2種細(xì)胞,設(shè)空白對(duì)照組和高、中、低劑量組共8組。高、中、低的棘霉素終濃度分別為1.0、2.0、4.0μg/L。作用細(xì)胞12 h后,收集細(xì)胞于離心管中。細(xì)胞裂解(注:冰上操作)細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗2遍,轉(zhuǎn)入1.5 m L EP管中,離心后加入100μL細(xì)胞裂解液放置,4℃裂解40 min。4℃, 10 000 g,30 min離心濃縮,將上清液轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中,保存于―70℃待用。用BCA法測定蛋白含量,取蛋白樣品等量,每個(gè)樣品中加入上樣緩沖液。將從K562和K562/Ima細(xì)胞中提取的10μg蛋白樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,進(jìn)行免疫印跡分析。過程如下:用脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉,加入1∶1 000稀釋的一抗,常溫孵育2 h,用含體積分?jǐn)?shù)0.1%Tween 20的TBS洗膜3次,加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,常溫孵育45 min,用含體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween 20的TBS洗膜3次,加入發(fā)光劑,曝光顯影。

1.4 SPK的活性檢測

參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行,分別收集處于對(duì)數(shù)生長期、細(xì)胞濃度約為5×106U/m L的K562、K562/Ima細(xì)胞,離心,加入細(xì)胞裂解緩沖液,凍融裂解3次;4℃, 14 000 g離心20 min,收集上清液。蛋白定量后取45μL樣品和Sphingosine(溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% Triton X-100)中混勻;在同位素室內(nèi)加入2.5μL/管(32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)含MgCl2(200 mmol/L),37℃反應(yīng)5～15 min;加入1 mol/LHCl 5μL和氯仿0.2 m L氯仿∶甲醇∶鹽酸(體積比100∶200∶1)劇烈振蕩,終止反應(yīng);再加入氯仿60μL和2mol/L氯化鉀60μL,12 000 g離心5 min;棄去水相,取15μL有機(jī)相樣品點(diǎn)樣于硅膠上,于層析液中展開40 min;放射自顯影;掃描結(jié)果,用圖像分析軟件Scionimɑge分析光密度。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)ERK1/2表達(dá)的影響

K562/Ima相對(duì)于K562的RF為24。棘霉素對(duì)K562細(xì)胞及K562/Ima細(xì)胞的IC50分別為0.82μg/L和0.87μg/L。對(duì)ERK1/2的表達(dá),見圖1。

圖1 棘霉素影響K562、K562/Ima細(xì)胞中ERK1/2的表達(dá)

2.2 對(duì)AKT表達(dá)的影響(見圖2)

圖2 棘霉素影響K562、K562/Ima細(xì)胞中AKT的表達(dá)

2.3 細(xì)胞中SPK的活性(見圖3)

γ-32P法檢測K562/Ima和K562細(xì)胞中SPK活性結(jié)果,見圖3。

圖3 SPK活性的TLC結(jié)果

3 討論

Boulton等[4]分離鑒定了一種蛋白激酶的cDNA序列,并證實(shí)多種細(xì)胞外信號(hào)均可激活該蛋白激酶。因此,將其命名為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ERK1),分子量為44KD。1991年,Boulton等[5]又鑒定了大鼠ERK亞家族的一個(gè)主要成員ERK2,分子量為42KD。ERK主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等激活而磷酸化(p-ERK),進(jìn)入細(xì)胞核作用于Elk21、c-myc、AP21等轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)部的重要介質(zhì),也是聯(lián)系細(xì)胞膜受體與細(xì)胞內(nèi)重要調(diào)節(jié)靶目標(biāo)的進(jìn)化保守的酶類。Steinmetz等[7]提出,MAPK磷酸酶(MKP-1)的表達(dá)提高與ERK1/2的滅活有關(guān)。通過對(duì)腫瘤細(xì)胞系的蛋白酶抑制劑的治療增加了MKP-1合成,減少ERK1/2的磷酸化,從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

PI-3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路)作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,通過影響下游凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等效應(yīng)分子的活性,在抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖中發(fā)揮著極為重要的作用。它具有以下作用:①促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖;②抑制細(xì)胞凋亡;③促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;④促進(jìn)血管生成;⑤抵抗化療和放療中的細(xì)胞凋亡。AKT作為生長因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要成員,可受多種細(xì)胞因子和理化因素激活,是聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的關(guān)鍵分子[8]。

SPK-S1P信號(hào)通路是近年來被許多研究者所重視的一條有關(guān)細(xì)胞存亡、增殖的信號(hào)途徑。SPK是一種高度保守的脂類激酶,可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。細(xì)胞內(nèi)S1P的水平受SPK活性的調(diào)節(jié)。S1P是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種同時(shí)具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外雙重功能的膜磷脂代謝產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi),S1P是一個(gè)重要的第二信使,能動(dòng)員Ca2+離子的釋放和活化多種酶類;在細(xì)胞外,S1P可以通過與細(xì)胞表面特異性受體EDGs結(jié)合,活化多種信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化等多種生命活動(dòng)。

我們的研究結(jié)果顯示,K562/Ima細(xì)胞中ERK的磷酸化程度高于K562細(xì)胞。無論是對(duì)于K562細(xì)胞還是K562/Ima細(xì)胞,棘霉素都對(duì)ERK和AKT有不同程度的抑制作用。

綜上所述,棘霉素不但能抑制K562細(xì)胞凋亡,也能抑制K562/Ima細(xì)胞的凋亡,IC50分別為0.82μg/L和0.87μg/L。機(jī)制可能與抑制ERK和AKT的磷酸化有關(guān),對(duì)K562/Ima抑制作用可能還與抑制SPK的活性有關(guān)。另外,從實(shí)驗(yàn)中也可以看出伊馬替尼的耐藥機(jī)制可能與ERK的磷酸化程度高、SPK表達(dá)高有關(guān),這也與前期的研究相一致[9],對(duì)棘霉素的研究有望為CML的治療提供新的思路。

[1]安明榜.格列衛(wèi)(甲磺酸伊馬替尼)——一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)[J].藥學(xué)與臨床研究,2010,18(2):101.

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[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Effect of echinomycin on ERK，AKT and SPK expression between K562 and K562/Ima cells

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun2*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑceutiɑl College，Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveThis study was aimed to explore the effect of echinomycin on the K562 and K562/Ima cells.MethodsIn experiments，the cells proliferation was detected by MTT assay.ERK，AKT and SPK were examed by Western blot assay，TLC in K562 and K562/Ima cells，respectively.ResultsThe results revealed the IC50of echinomycin in K562 and K562/Ima were 0.82 mg/L and 0.87 mg/L，respectively.The ERK and AKT were inhited by echinomycin in K562 and K562/Ima.The expression of SPK was up-regulated in K562/Ima cells，and echinomycin on SPK activity in resistant cells had obvious inhibitory effect.ConclusionEchinomycin can inhibits the proliferation of K562 and K562/Ima cells，and its mechanism may be related to inhibition of ERK，AKT and SPK.

echinomycin；K562；resistance；ERK；AKT；SPK

R966

A

1672―7606(2015)04―0232―04

2015-10-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30472082)

許嚴(yán)偉(1981―),男,河南洛陽人,主管藥師,從事腫瘤藥理學(xué)及臨床藥理學(xué)研究工作。

*通信作者:杜鋼軍(1971―),男,河南開封人,博士,教授,從事腫瘤藥理學(xué)研究工作。