鐘 曦，秦 克，王導新

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400010)

·論 著·

重組慢病毒沉默rictor基因?qū)TORC2/SGK1信號通路及肺泡上皮鈉離子通道的調(diào)控作用*

鐘 曦，秦 克，王導新△

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400010)

目的構(gòu)建針對mTORC2特異組成蛋白中rictor基因的重組慢病毒沉默載體，研究其對mTORC2/SGK1信號通路的調(diào)控機制及其對肺泡上皮細胞鈉離子通道的影響,并探討其在急性呼吸窘迫綜合征及急性肺損傷中的作用。方法構(gòu)建目的基因的rictor干擾質(zhì)粒及空載質(zhì)粒并與慢病毒包裝體系共轉(zhuǎn)染293T細胞，收集病毒上清液，經(jīng)離心、濃縮及純化獲取重組慢病毒。測定病毒滴度，感染A549細胞并篩選細胞穩(wěn)定株，RT-PCR驗證目的基因rictor沉默情況。采用PCR和western blot檢測該通路中各信號指標表達情況。結(jié)果成功構(gòu)建沉默rictor基因的重組慢病毒并感染A549細胞和獲得細胞穩(wěn)定株。與空白組及對照組相比，shRNA-rictor組中rictor和下游SGK1、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC mRNA水平均有明顯下降(P<0.05)。同時，shRNA-rictor組中rictor和下游SGK1、P-SGK、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC的蛋白水平較前兩組均有明顯下降(P<0.05)。結(jié)論沉默rictor基因?qū)TORC2/SGK1信號通路有明顯的調(diào)控作用，同時從基因和蛋白水平影響肺泡上皮細胞α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC的表達。mTORC2/SGK1可能是調(diào)控肺泡上皮細胞對肺泡液的清除能力，同時影響肺水腫形成的重要信號通路。

呼吸窘迫綜合征，成人；rictor基因；慢病毒屬

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由各種直接和間接致病因素導致的肺泡細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，而肺泡周圍大量炎癥因子浸潤造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導致嚴重的低氧性呼吸功能不全[1]。以往在針對急性肺損傷及呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的治療中主要是運用抗感染、抗炎等方法,降低因肺內(nèi)大量炎性滲出所導致的毛細血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障功能障礙。部分文獻報道，增加肺泡上皮細胞對肺內(nèi)多余液體的清除能力，也是控制急性肺損傷的惡化及減少難治性低氧血癥發(fā)生率的有效途徑[2]。肺泡Ⅱ型上皮細胞與肺水清除(alveolar fluild clearance，AFC)有密切關系[3]，有研究表明，阿米洛利敏感鈉離子通道廣泛分布于肺泡Ⅱ型上皮細胞中，也是調(diào)節(jié)肺水交換的重要效應機制[4]。SGK1作為重要的AGC激酶 (protein kinaseA,G,C)可有效調(diào)控下游鈉離子通道的活化及表達[5]，在肺水清除中起到重要作用。本實驗研究通過構(gòu)建重組慢病毒載體沉默mTORC2蛋白復合體中特異性基因rictor，從靶基因干擾方向深入研究rictor-mTORC2復合體，mTORC2/SGK1信號通路對肺上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel，ENaC)的調(diào)控機制。

表1 引物序列

1 材料與方法

1.1 材料 A549細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)細胞庫。shRNA-rictor,nonsilencing shRNA及慢病毒載體由上海吉凱基因化學公司提供。Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物及DNA marker均由日本TaKaRa公司提供；western blot配膠試劑盒購自西安碧云天生物技術公司。RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清、0．25%胰蛋白酶均購自Gibco公司。rictor單克隆抗體，SGK1及P-SGK單克隆抗體購自美國Immunoway公司；ENa Sodium chanel 單克隆抗體購自英國Abcam公司。β-actin多克隆抗體購自美國Proteintech公司。HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自美國Abbkine公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將A549細胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放于37 ℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達90%以上，成對數(shù)生長期時，可進行后續(xù)實驗。

1.2.2 shRNA-rictor慢病毒感染質(zhì)粒的設計及構(gòu)建 根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中A549細胞rictor基因mRNA序列，經(jīng)過評估及BLAST系統(tǒng)排除同源cDNA，設計shRNA干擾靶序列5′-AAACTTGTGAAGAATCGTATC-3′；合成shRNA對應的DNA Oligo，退火后形成雙鏈DNA。將其與經(jīng)過Age I和EcoR I兩位點酶切后的GV115載體鏈接，將鏈接體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用PCR法對陽性克隆進行鑒定。PCR引物為上游：CCATGATTCCTTCATATTTGC；下游：GTAATACGGTTATCCACGCG。

1.2.3 慢病毒的包裝和病毒滴度的測定 病毒包裝前24 h，將293T細胞以1×105/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中。按Lipofectamine 2000試劑盒說明書提示，將慢病毒質(zhì)粒包裝體系(Lenti-Easy Packaging Mix、GFP shRNA Plasmid及Opti-MEM)與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒按比例稀釋混勻并移至293T細胞培養(yǎng)皿中，8 h后棄轉(zhuǎn)染液，用DMEM繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集病毒上清液，經(jīng)過濾、離心、濃縮及純化，保存于-80 ℃冰箱。本實驗采用熒光計數(shù)法進行病毒滴度測定，將293T細胞以5×103/孔的密度接種于96孔板，貼壁后，將待測病毒以10倍梯度稀釋，分別加入96孔板中，96 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況并統(tǒng)計。

1.2.4 重組慢病毒感染A549細胞和篩選細胞穩(wěn)定株 以密度8×104/孔接種A549細胞于6孔板中，待融合率達30%時，用重組慢病毒感染A549細胞。設空白組、陰性對照組、shRNA-rictor組，每組設計3個復孔。預實驗設計感染復數(shù)MOI=20、50、100，將終濃度為5 μg/μL的Polybrene和Enhanced infection solution與相應體積的重組慢病毒懸液混勻加入6孔板。3～4 d后熒光顯微鏡下觀察細胞感染率。繼續(xù)培養(yǎng)感染成功的目的細胞，用嘌呤霉素篩選細胞穩(wěn)定株。

1.2.5 RT-PCR檢測rictor基因及SGK1、ENaC 3個亞基的mRNA表達水平 提取各組A549細胞總RNA，依據(jù)DRR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照RR901A 擴增試劑盒說明書建立反應體系，PCR 擴增目的和內(nèi)參基因，引物序列見表1。

1.2.6 western blot檢測各組細胞rictor、SGK1、P-SGK及ENaC的蛋白表達水平 提取總蛋白，用BCA檢測法進行蛋白定量。各組蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(PVDF膜)。用PBST配制5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗體rictor(1∶800)、SGK1(1∶1 000)、P-SGK1(1∶500)、α-ENaC(1∶500)、β-ENaC(1∶500)、γ-ENaC(1∶500)于抗體孵育盒，4 ℃孵育過夜；PBST(或TBST)洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記的二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h；PBST(或TBST)洗膜3次，每次15 min。ECL試劑盒顯色，凝膠系統(tǒng)成像，并用Quantity One軟件系統(tǒng)分別分析目的條帶與β-actin的比值表示rictor，SGK1，P-SGK1，ENaC的α，β，γ 3個亞基蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒陽性克隆的驗證、滴度檢測并感染目的細胞建立細胞穩(wěn)定株

2.1.1 陽性克隆的PCR鑒定 將陽性克隆的寡核苷酸序列，經(jīng)退火、酶切、鏈接等過程，用PCR法鑒定。重組慢病毒的PCR產(chǎn)物在139 bp，測序結(jié)果表明合成的rictor shRNA寡核苷酸序列插入正確，命名為shRNA-rictor。

2.1.2 重組慢病毒滴度檢測 將包裝好的病毒進行梯度稀釋，再感染A549細胞，并利用熒光顯微鏡檢測各孔板中GFP的陽性細胞數(shù)量，其shRNA-rictor組慢病毒滴度為1.2×108TU/mL，nonsilencing-shRNA組慢病毒滴度為1.0×108TU/mL。

2.1.3 重組慢病毒感染目的細胞 將包裝好的慢病毒感染A549細胞，96 h后熒光顯微鏡下計數(shù)有GFP表達的細胞數(shù)量及細胞總數(shù)，統(tǒng)計后shRNA-rictor組感染效率約60%,nonsilencing-shRNA組感染效率50%，確定陽性組最佳感染復數(shù)MOI為50 TU/mL，表明感染成功(圖1)。

2.1.4 嘌呤霉素篩選目的細胞并建立細胞穩(wěn)定株 將慢病毒感染過的細胞用不同濃度梯度的嘌呤霉素篩選，經(jīng)預實驗后發(fā)現(xiàn)0.5 μg/mL是最佳篩選濃度，繼續(xù)培養(yǎng)細胞并獲得純化的目的細胞，轉(zhuǎn)染效率達90%以上(圖2)。

2.1.5 目的細胞中rictor基因mRNA水平的驗證及檢測 提取各組總RNA,RT-PCR檢測顯示，相比空白組和陰性對照組，shRNA-rictor組中rictor mRNA表達明顯低于前兩組(P=0.029)。而空白組與nonsilencing-shRNA比較，rictor mRNA無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

A、B：空載組；C、D：shRNA-ricton組。

圖1 shRNA-rictor慢病毒載體及空載組感染A549細胞后熒光顯微鏡下GFP表達情況(200×)

M=marker；*：P<0.05，與對照組比較。

圖3 RT-PCR檢測各組rictor基因的mRNA表達水平

2.2 RT-PCR法檢測檢測SGK1,α-ENaC,β-ENaC,γ-ENaC mRNA表達水平 shRNA-rictor組中SGK1 mRNA的表達水平也明顯低于空白組及陰性對照組(P=0.026,0.003,0.000，0.003，P<0.05)。以上結(jié)論成功證實運用重組慢病毒載體感染A549細胞系進行對目的基因rictor的調(diào)控有效，并同時調(diào)控下游信號因子SGK1、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC mRNA表達水平(圖4、圖5)。

M=DNA Marker；*：P<0.05，與對照組比較。

圖4 RT-PCR檢測各組A549細胞SGK1的mRNA表達水平

2.3 western blot法檢測各組細胞中rictor,SGK1，P-SGK的蛋白表達水平 shRNA-rictor組中rictor，SGK1，P-SGK的蛋白表達水平明顯低于空白組及陰性對照組(P=0.002，0.000，0.012;P<0.05)。而空白組與陰性對照組之間各目的蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)，見圖6。

2.4 western blot法檢測各組細胞中鈉離子通道3個亞基α-ENaC,β-ENaC及γ-ENaC的蛋白表達水平 shRNA-rictor組中的α-ENaC,β-ENaC及γ-ENaC蛋白表達水平明顯低于空白組及陰性對照組(P=0.002,0.000,0.001，P<0.05)。而空白組與陰性對照組之間各目的蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)，見圖7。

M=DNA Marker；*：P<0.05與對照組比較;**：P>0.05與空白組比較。

圖5 RT-PCR檢測各組A549細胞α-ENaC,β-ENaC及γ-ENaC的mRNA表達水平

*：P<0.05，與對照組比較;**：P>0.05，與空白組比較。

圖6 western blot法檢測各組A549細胞rictor，SGK1，P-SGK的蛋白表達水平

*：P<0.05與對照組比較;**：P>0.05與空白組比較。

圖7 western blot法檢測各組A549細胞α-ENaC, β-ENaC及γ-ENaC的蛋白表達水平

3 討 論

急性肺損傷的嚴重階段是急性呼吸窘迫綜合征，以肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，導致嚴重的肺水腫，肺通氣功能障礙，頑固性低氧血癥等[6-7]。慢性阻塞性肺疾病惡化的主要原因是肺內(nèi)大量中性粒細胞、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質(zhì)的浸潤及肺水清除能力障礙。所以臨床治療上，通過抗感染、抗炎、利尿等治療的同時，采用其他可能的途徑提高肺水清除能力，維持毛細血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障的穩(wěn)定平衡是改善低氧血癥，重度肺源性心臟病，及降低ALI/ARDS死亡率的另一種手段。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，以mTORC1及mTORC2兩種形式存在于生物體中。mTORCl由mTOR、PRAS40、Raptor和mLST8/GpL組成。mTORC2包括mTOR、PRR5、mLST8/GpL、rictor和mSINl。不同于其它亞基，rictor是mTORC2中的特異性組成部分。據(jù)文獻證實，rictor與culin-1 鏈接組成E3泛素連接酶，可增加下游SGK1的泛素化，同時SGK1可反作用于rictor磷酸化位點T1135[8-9]。因此，rictor-mTORC2復合體與SGK1之間存在緊密的雙向調(diào)控機制。本實驗通過沉默rictor基因后，發(fā)現(xiàn)SGK 磷酸化位點Ser422明顯下調(diào)，證明SGK1是受PI3K/mTORC2通路的調(diào)控。這一結(jié)果和國際上的觀點是保持一致的。

有國內(nèi)外文獻報道，參與調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)液體轉(zhuǎn)運主要是通過ENaC，Na+-K+-ATPase，水通道蛋白(AQP)等方式實現(xiàn)[10]。其中ENaC離子通道是一種跨膜蛋白，其屬于阿米洛利敏感性電壓門控通道。主要位于肺泡上皮細胞頂側(cè)膜，由α、β、γ 3種亞基構(gòu)成的多聚體。而α亞基發(fā)揮了最主要的生物學功能，負責鈉離子的重吸收利用，及調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外環(huán)境。在通過敲除α-ENaC基因的小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)實驗組在40 h后死于急性肺水腫引起的呼吸衰竭[11]。一方面，ENaC在位于上皮細胞基底膜的Na+-K+-ATPase幫助下參與水跨膜轉(zhuǎn)運和肺水清除[12]。另一方面，國際上大部分相關研究表明，ENaC的活性是受到SGK1下游nedd4信號因子的直接調(diào)控。而對于nedd4如何調(diào)控ENaC的內(nèi)部機制的討論尚不統(tǒng)一，有部分文獻證明，mTORC2/SGK1信號通路可激活下游nedd4-2的WWP2磷酸化位點，以降低nedd4家族中E3泛素連接酶對ENaC的負向調(diào)控[13-14]。因此，可推測SGK1與nedd4-2可能是通過磷酸化和泛素化的協(xié)同作用調(diào)控ENaC活性。本團隊也將在以后的研究中對這一機制做更深入的探討。

本課題組前期通過大量體內(nèi)，體外研究已證明，采用mTORC1的抑制劑雷帕霉素干預時，檢測鈉離子通道蛋白表達無明顯改變，而采用mTORC1及mTORC2雙效抑制劑PP242干預時，鈉離子蛋白表達有明顯下降。同時，組織學檢測提示肺組織水腫情況加重。而利用糖皮質(zhì)激素、胰島素、表皮生長因子等藥物調(diào)控PI3k/mTOR/SGK1信號通路，可明顯上調(diào)鈉離子通道對肺泡液的轉(zhuǎn)運能力[15-16]。以上結(jié)果提示，PI3K/mTORC2/SGK1信號通路是調(diào)控ENaC的主要途徑。而慢病毒是一種以HIV病毒為基礎發(fā)展而來的免疫缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒。相比早期的脂質(zhì)體，質(zhì)粒等轉(zhuǎn)染載體，它具有穩(wěn)定性，高敏感性，易感性等優(yōu)勢[17-18]。近年重組慢病毒shRNA技術被廣泛應用于內(nèi)源性基因分析，信號轉(zhuǎn)導通路研究。本實驗通過設計目的基因rictor干擾序列，構(gòu)建shRNA質(zhì)粒及重組慢病毒載體，并成功感染目的細胞建立穩(wěn)定株，沉默mTORC2中特異性基因rictor，從基因?qū)用鏈蚀_證明mTORC2/SGK1是調(diào)控ENaC離子通道的高特異性信號通路，同時進一步深入探討了rictor-mTORC2蛋白復合體對鈉離子通道的內(nèi)部調(diào)控機制。從分子生物學的角度，有效的證明mTORC2/SGK1信號通路是調(diào)節(jié)鈉通道的關鍵。并推斷此信號通路可能是影響肺水清除的有效途徑。此實驗結(jié)論為提高肺水清除能力，糾正急性肺水腫的臨床研究提供了部分理論基礎，同時也為拓展ALI和ARDS臨床治療方向提供了一定的理論思路。

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Regulating effect of recombinant lentivirus silencing rictor gene on mTORC2/SGK1 signal pathway and pulmonary alveolar epithelial sodium ion channel*

ZhongXi,QinKe,WangDaoxin△

(DepartmentofRespiratoryMedicine,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentivirus silence vector aiming at rictor gene in mTORC2 specific protein,and to investigate its regulation on mTORC2/SGK1 signal pathway and the effect on pulmonary alveolar epithelial sodium ion channel，as well as the role in acute respiratory distress syndrome(ARDS) and acute lung injury.MethodsThe interfering vector plasmid and empty vector plasmid of target gene rictor were constructed,which and the lentivirus packaging system were co-transfected to 293T cells.The viral supernatant was collected,centrifuged,concentrated and purified for obtaining recombinant lentivirus.The virus titer was detected and the virus was infected to A549 cells.Stable cell lines were screened.RT-PCR was used to confirm the silencing situation of target gene rictor.The expression situation of various signal indexes in this pathway was detected by PCR and Western blot.ResultsThe recombinant lentivirus of silence gene rictor was successfully constructed and transfected to A549 cell for obtaining stable cell lines.Compared with blank and control groups,the mRNA levels of rictor,downstream SGK1 and α-，β-and γ-ENaC in the shRNA-rictor group were significantly decreased (P<0.05).Meanwhile,the protein levels of rictor,downstream SGK1,P-SGK and α-，β-and γ-ENaC in the shRNA-rictor group were significantly decreased compared with the other two groups(P<0.05).ConclusionSilence rictor gene has the obvious regulation effect on mTORC2/SGK1 signal pathway,meanwhile affects the expression of pulmonary alveolar epithelial cellular α-，β-and γ-ENaC at gene and protein level.It is speculated that mTORC2/SGK1 may be an important signal pathway for regulating the clearance capacity of pulmonary alveolar epithelial cells on pulmonary alveolar fluid and simultaneously affecting the pulmonary edema formation.

respiratory distress syndrome,adult;rictor gene；lentivirus

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.001

國家自然科學基金資助項目(81270141)

：鐘曦(1984-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸危重癥臨床及基礎研究?！?/p>

，E-mail:weanger2008@163.com。

R563.8

A

1671-8348(2015)26-3601-04

2015-04-08

2015-06-01)