楊少芬，池秀芳

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理教研室，廣州 510925；2廣東省婦幼保健院新生兒科，廣州 510010)

論著·臨床研究

肝癌患者高表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1預(yù)后差

楊少芬1，池秀芳2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理教研室，廣州 510925；2廣東省婦幼保健院新生兒科，廣州 510010)

目的 神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1(L1CAM)在肝癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系。方法對(duì)110例肝癌樣本用Western blot及qRT-PCR方法檢測(cè)L1CAM蛋白和mRNA的表達(dá)，分析了L1CAM表達(dá)與肝癌患者總體生存率的關(guān)系。結(jié)果肝癌組織L1CAM蛋白、mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)非腫瘤組織(P<0.01)；在中-低分化肝癌患者L1CAM表達(dá)量高于高分化肝癌患者 (P<0.01)；L1CAM mRNA的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)；采用Kaplan-Meier法生存分析，高表達(dá)L1CAM患者預(yù)后差(P<0.01)。結(jié)論L1CAM與肝癌的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，或許可作為評(píng)估肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

癌，肝細(xì)胞；神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1；預(yù)后

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例高達(dá)748 300例[1-2]，由于肝癌極易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，導(dǎo)致其病死率一直高居不下[3]，因此，找到一種能夠預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記物是非常有必要的。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1(L1CAM) 為免疫球蛋白超家族成員之一，近年研究表明，L1CAM在腫瘤的演變過(guò)程中起著重要作用，已發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[4]、卵巢癌[5]、胰腺癌[6]等不同類(lèi)型腫瘤中均有表達(dá)。為了研究L1CAM與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)及蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)方法分析肝癌及配對(duì)癌旁組織L1CAM的表達(dá)，探討其與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院肝癌手術(shù)切除標(biāo)本110例，其中男95例，女15例，年齡31～78歲，中位年齡為47歲。標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除離體時(shí)，盡快選取組織，每塊組織大約0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，肝癌組織取自癌灶，術(shù)后病理診斷均為肝細(xì)胞癌；相對(duì)正常的肝組織取自切除肝臟中腫瘤病灶的遠(yuǎn)端切緣(經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)無(wú)癌組織浸潤(rùn))。所有患者均有完整的臨床資料及隨訪信息，所有病例術(shù)前均未行放療、化療等輔助治療。本課題所有病例術(shù)前均已簽署科研知情同意書(shū)。肝細(xì)胞癌的診斷和組織學(xué)分類(lèi)是根據(jù)2000年世界衛(wèi)生組織提出的腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。依據(jù)腫瘤分化程度將110例肝癌患者分為高分化組及中-低分化組；以110例肝癌組織中L1CAM mRNA相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為臨界值，將所有患者分為L(zhǎng)1CAM高表達(dá)組和L1CAM低表達(dá)組。

1.2 方法

1.2.1 Western blot 5例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織樣品經(jīng)RIPA裂解提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)進(jìn)行蛋白定量，每種樣品各取40 μg上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將凝膠上蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST充分洗滌后采用ECL化學(xué)發(fā)光法觀察結(jié)果。

1.2.2 qRT-PCR 所有標(biāo)本總RNA提取采用Trizol(Invitrogen公司)裂解，所有操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所得RNA采用qRT-PCR試劑盒(TAKARA公司)根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。L1CAM基因上、下游引物(上海生物工程公司)序列分別為：5′-ACG AGG GAT GGT GTC CAC TTC AAA-3′;5′-TTA TTG CTG GCA AAG CAG CGG TAG-3′。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo) L1CAM在肝癌組織標(biāo)本的表達(dá)；L1CAM mRNA在肝癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；肝癌患者L1CAM表達(dá)量與預(yù)后關(guān)系?；颊呖偵媛始靶g(shù)后生存時(shí)間的計(jì)算為手術(shù)日期至患者死亡日期或最后隨訪日期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存函數(shù)采用Kaplan-Meier法并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 L1CAM在肝癌組織標(biāo)本的表達(dá) Western blot顯示L1CAM在肝癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，見(jiàn)圖1；qRT-PCR顯示L1CAM mRNA在肝癌組織的中位表達(dá)水平為2.71，其在對(duì)應(yīng)癌旁組織的中位表達(dá)水平為1.49，在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P<0.01)，見(jiàn)圖2。L1CAM mRNA表達(dá)量在中-低分化組明顯高于在高分化組(中位表達(dá)量：3.38vs.2.14，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

NT：癌旁組織；T：肝癌組織。

圖1 L1CAM 蛋白在肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織的表達(dá)

圖2 L1CAM基因在肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織的mRNA表達(dá)

圖3 L1CAM基因在不同分化程度肝癌組織的表達(dá)

2.2 L1CAM mRNA在肝癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 L1CAM 的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、血清AFP水平、HBsAg、肝硬化未見(jiàn)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 L1CAM mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

續(xù)表1 L1CAM mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 肝癌高表達(dá)L1CAM預(yù)后差 Kaplan-Meier生存分析曲線結(jié)果顯示，L1CAM低表達(dá)組的第1、3年生存率及生存時(shí)間顯著高于L1CAM高表達(dá)組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 L1CAM表達(dá)與肝細(xì)胞癌預(yù)后

3 討 論

肝細(xì)胞癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其極易發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者術(shù)后5年生存率一直居高不下[7-8]。目前尚無(wú)有效預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，因此，尋找一種有效預(yù)測(cè)臨床預(yù)后的分子標(biāo)記物具有重大的社會(huì)價(jià)值。

L1CAM也稱(chēng)之為CD171，分子量大小在200×103～220×103，是一種細(xì)胞黏附受體，為免疫球蛋白超家族中的一員，包含有6個(gè)免疫球蛋白樣的區(qū)域及5個(gè)纖維連接蛋白3型區(qū)域[9]。近年有學(xué)者研究表明，L1CAM可以使乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡減少并促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，該作用機(jī)制可能是激活了β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附減弱，而更具侵襲性[10]；Gavert等[11]通過(guò)研究L1CAM與大腸癌的關(guān)系后認(rèn)為，L1CAM可以活化核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)，該信號(hào)通路與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，NF-κB的激活又進(jìn)一步加強(qiáng)了L1CAM對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移作用；Weidle等[12]發(fā)現(xiàn)L1CAM可作為鑒別良、惡性黑色素細(xì)胞的鑒別標(biāo)志物；Zechini等[5]研究卵巢癌與L1CAM關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，其可作為卵巢癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，高表達(dá)L1CAM患者預(yù)后差；但其在肝癌中起到何種作用的相關(guān)報(bào)道甚少。

本研究表明L1CAM在肝癌組織中表達(dá)增高，其表達(dá)量與腫瘤的分化程度、TNM分期密切相關(guān)，L1CAM表達(dá)水平與肝癌患者總體生存率及術(shù)后存活時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果與近年對(duì)L1CAM在其他腫瘤提示其為癌基因的結(jié)論相符[13-14]，但其與肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

[1]El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med,2011，365(12):1118-1127.

[2]Parkin DM,Pisani P,Ferlay J.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,1999,49(1):33-64.

[3]European Association for Study of Liver，European Organisation for Research and Treatment of Cancer.EASL-EORTC clinical practice guidelines:management of hepatocellular carcinoma[J].Eur J Cancer,2012,48(5):599-641.

[4]Tsuzuki T,Izumoto S,Ohnishi T,et al.Neural cell adhesion molecule L1 in gliomas:correlation with TGF-beta and p53[J].J Clin Pathol,1998,51(1):13-17.

[5]Zechini S,Bianchi M,Colombo N,et al.The differential role of L1 in ovarian carcinoma and normal ovarian surface epithelium[J].Cancer Res,2008,68(4):1110-1118.

[6]Bergmann F,Wandschneider F,Sipos BA,et al.Elevated L1CAM expression in precursor lesions and primary and metastastic tissues of pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Oncol Rep,2010,24(4):909-915.

[7]Lim KC,Chow P,Allen JC,et al.Systematic review of outcomes of liver resection for early hepatocellular carcinoma within the Milan criteria[J].Br J Surg,2012,99(12):1622-1629.

[8]Takayama T.Surgical treatment for hepatocellular carcinoma[J].Jpn J Clin Oncol,2011,41(4):447-454.

[9]Kiefel H,Bondong S,Hazin J,et al.L1CAM A major driver for tumor cell invasion and motility[J].Cell Adh Migr,2012,6(4):374-384.

[10]Shtutman M,Levina E,Ohouo P,et al.Cell adhesion molecule L1 disrupts E-cadherin-containing adherens junctions and increases scattering and motility of MCF7 breast carcinoma cells[J].Cancer Res,2006,66(23):11370-11380.

[11]Gavert N，Ben-Shmuel A,Lemmon V,et al.Nuclear factor-kappaB signaling and ezrin are essential for L1-mediated metastasis of colon cancer cells[J].J Cell Sci,2010,123(Pt 12):2135-2143.

[12]Weidle UH,Eggle D,Klostermann S.L1-CAM as a target for treatment of cancer with monoclonal antibodies[J].Anticancer Res,2009,29(12):4919-4931.

[13]Min JK,Kim JM,Li SJ,et al.L1 cell adhesion molecule is a novel therapeutic target in intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2010,16(14):3571-3580.

[14]Tischler V,Pfeifer M,Hausladen S,et al.L1CAM protein expression is associated with poor prognosis in non-small cell lung cancer[J].Mol Cancer,2011,10:127.

High level of L1CAM predicting poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients

YangShaofen1，ChiXiufang2

(1.VocationalCollegeofHealth，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong510925,China；2.DepartmentofNeonatology,GuangdongWomenandChildrenHospital,Guangzhou,Guangdong510010,China)

Objective To investigate the clinical significance and prognostic value of PKD3 expression in human hepatocellular carcinoma (HCC) after hepatectomy.MethodsWe analyzed mRNA expression of L1CAM in 110 HCCs by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and western blot,and the relationship among the overall survival of HCCs.ResultsThe relative protein and mRNA expression level of L1CAM was up-regulated in HCCs comparing with adjacent non tumor liver tissues (P<0.01).L1CAM expression in the well-differentiated group was higher than that in the poor-differentiated group (P<0.01).The expression of L1CAM mRNA was significantly correlated with tumor differentiation and TNM stage (P<0.05).The prognosis of patients with high expression L1CAM was poor (P<0.01).ConclusionL1CAM expression is related to occurrence and development of HCCs and may predict the prognosis of HCCs after hepatectomy.

carcinoma,hepatocellular；neural cell adhesion molecule L1；prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.22.011

楊少芬(1969-)，副教授，本科，主要從事病理學(xué)教學(xué)及研究工作。

R365

A

1671-8348(2015)22-3055-03

2015-02-08

2015-07-10)