彭方毅，崔玉花，馬明炎，李元寬，鄔紅雨，姜海蓉△，周 歡

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶市墊江縣中醫(yī)院檢驗科 408300)

論著·基礎(chǔ)研究

肺彈性蛋白降解肽段人工抗原的合成與鑒定*

彭方毅1,2，崔玉花1，馬明炎2，李元寬2，鄔紅雨2，姜海蓉1△，周 歡1

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶市墊江縣中醫(yī)院檢驗科 408300)

目的 制備和鑒定肺彈性蛋白降解肽段人工抗原，為進(jìn)一步研制慢性阻塞性肺疾病(COPD)免疫檢測試劑盒打下良好基礎(chǔ)。方法以Sulfo-SMCC為偶聯(lián)劑，鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)為載體蛋白制備免疫原；經(jīng)紫外掃描和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)電泳鑒定偶聯(lián)情況；以免疫原免疫Balb/c小鼠制備特異性抗體，間接競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法評價抗血清效價及特異性。結(jié)果紫外掃描和SDS-PAGE電泳確認(rèn)了肺彈性蛋白降解肽段人工抗原合成成功，其蛋白濃度為1.181 mg/mL，抗血清效價高于1∶64 000，IC50為13.7 ng/mL，抗血清與無關(guān)肽段無交叉反應(yīng)。結(jié)論本實驗成功制備了肺彈性蛋白降解肽段人工抗原，其具有較好的免疫原性，為建立快速準(zhǔn)確檢測COPD免疫檢測方法奠定基礎(chǔ)。

肺彈性蛋白降解肽段；人工抗原；抗體

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見多發(fā)病，表現(xiàn)為不可逆性氣道阻塞的慢性支氣管炎和肺氣腫[1]，患病率約為3%，嚴(yán)重影響患者的健康和生命質(zhì)量。與肺氣腫發(fā)生有關(guān)的內(nèi)源性蛋白酶主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶，此酶能降解肺組織中的彈性硬蛋白、結(jié)締組織基質(zhì)中的膠原和蛋白多糖，破壞肺泡壁結(jié)構(gòu)[2]。任笑蒙等[3]在對肺氣腫表面活性物質(zhì)蛋白A、B的基因表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，彈性蛋白酶誘發(fā)的肺泡Ⅱ型上皮結(jié)構(gòu)和功能的改變直接導(dǎo)致了內(nèi)源性肺泡表面活性物質(zhì)的變性和壞死。He等[4]通過人類嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶對肺彈性蛋白進(jìn)行降解，將產(chǎn)生的肽混合物經(jīng)高效液相色譜/電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)部分肽段在COPD患者血漿和唾液中存在而在正常人中缺乏。本研究利用COPD患者特異存在的一段肺彈性蛋白降解肽段制備人工抗原，通過免疫小鼠制備高特異性的抗體，為建立快速準(zhǔn)確的COPD免疫檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 肺彈性蛋白降解肽段，由北京中科亞光生物科技有限公司合成；雞卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、Sulfo-SMCC均購自Thermo公司；GelCode Blue Stain Reagent染色液、0.2%溴酚藍(lán)、10.0%TEMED、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購自BIO-RAD公司；蛋白質(zhì)定量(BCA)試劑盒，購自Pierce公司。

1.1.2 儀器 紫外分光光度計(UV-2450)購自Shimadazu；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)電泳儀，由北歐生物科技(北京)有限公司提供；酶標(biāo)儀(VersaMax)購自Molecular Devices分子儀器有限公司；移液器購自Eppendorf公司；漩渦混合器(QL-901)購自江蘇海門其林貝爾；洗板機(jī)(ZMX-988B)購自北京天石醫(yī)療。

1.1.3 實驗動物 6～8周齡雌性Balb/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備[5-9]取360 μL的KLH(10 mg/mL)與40 μL的OVA(10 mg/mL)溶液混合，加入61 μL的Sulfo-SMCC(4.8 mg/mL)，37 ℃孵育30 min,每隔15 min輕柔混合1次。于混合液中加入1 mL的肺彈性蛋白降解肽段溶液(4 mg/mL)，室溫反應(yīng)2 h。在2～8 ℃條件下，將反應(yīng)液置于1 L體積的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析，至少換液5次。取出偶聯(lián)物，儲存于-20 ℃的冰箱中。

1.2.2 抗原的鑒定[10-13]

1.2.2.1 抗原濃度測定 參照BCA試劑盒的操作步驟，以牛血清清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，檢測562 nm處的吸光度(OD)值，以濃度為X值，以O(shè)D值為Y值，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算偶聯(lián)物的蛋白濃度。

1.2.2.2 SDS-PAGE電泳分析 用12%的分離膠，5%的濃縮膠對偶聯(lián)物、OVA進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳。

1.2.2.3 完全抗原、半抗原、載體蛋白的紫外分光光度法檢測 以1×PBS稀釋偶聯(lián)物、肺彈性蛋白降解肽段、OVA、KLH至0.1 mg/mL，在230～350 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.2.3 多抗血清(pAb)的制備 以完全抗原免疫8周齡小鼠6只，首次免疫以福氏完全佐劑乳化抗原，皮下分點注射，以腋下淋巴處為宜，免疫劑量為60 μg/只。后期免疫以福氏不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量為30 μg/只，每隔2周免疫1次，共免疫5次。

1.2.4 pAb的鑒定[14-16]

1.2.4.1 血清效價的測定 采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清效價，以10 ng/mL的包被抗原包被酶標(biāo)板100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗滌5次，拍干。血清以1∶1 000為起始濃度，4倍梯度稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗滌5次，拍干。加入辣根過氧化物酶[HRP-羊抗鼠IgG二抗(1∶25 000)]，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗滌5次，拍干。加入TMB顯色液100 μL/孔，37 ℃顯色15 min，加入2 mol/L H2SO4100 μL/孔終止。酶標(biāo)儀測定OD值，測定波長為450 nm,參考波長為650 nm，P/N值大于2.1倍以上為陽性孔。

1.2.4.2 血清特異性檢測 選擇效價高的抗血清，根據(jù)方陣滴度以O(shè)D值在2.0左右的稀釋度建立間接競爭ELISA法檢測血清特異性。將肺彈性蛋白降解肽段溶液稀釋成1 000.0、250.0、62.5、15.6 ng/mL的濃度。取與肺彈性蛋白降解肽段無關(guān)的其他肽段按同樣的方法稀釋，進(jìn)行間接競爭ELISA檢測評價抗血清特異性。

2 結(jié) 果

2.1 偶聯(lián)物蛋白濃度測定 BCA法蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，經(jīng)測定，結(jié)合物的兩復(fù)孔值分別為OD1=0.886，OD2=0.890。根據(jù)曲線計算得結(jié)合物溶液蛋白濃度為1.181 mg/mL。

2.2 SDS-PAGE電泳圖 由于KLH分子量在4.5×108～1.3×1010之間，分子量過大在電泳圖上無法可見。因此在反應(yīng)體系中加入了10%的OVA以驗證偶聯(lián)是否成功。由圖2所示，根據(jù)Marker條帶可知，OVA條帶在43×103左右，偶聯(lián)物條帶較OVA大，由此分析可知肺彈性蛋白降解肽段與OVA偶聯(lián)成功，證明反應(yīng)體系沒問題，可認(rèn)為肺彈性蛋白降解肽段與KLH偶聯(lián)成功。

2.3 紫外掃描結(jié)果 紫外掃描顯示KLH，OVA均在280 nm處有最大吸收峰，肺彈性蛋白降解肽段沒有吸收峰，偶聯(lián)物在278 nm處有最大吸收峰，與KLH，OVA相比發(fā)生了部分偏移。由此分析可得肺彈性蛋白降解肽段與KLH偶聯(lián)成功，見圖3。

2.4 抗血清效價測定 被免疫的6只小鼠除了8號均產(chǎn)生了較強抗體，第3次血清效價相對于第2次血清效價有所增高。其中7號小鼠血清效價最高，第3次血清效價大于1∶64 000。

圖1 BCA法蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

1：Marker；2：偶聯(lián)物；3：OVA。

圖2 偶聯(lián)物及OVA的SDS-PAGE電泳圖

1：KLH；2：偶聯(lián)物；3：OVA；4：肺彈性蛋白降解肽段。

圖3 KLH、OVA、肺彈性蛋白降解肽段及偶聯(lián)物的紫外光譜圖

2.5 血清特異性鑒定 通過方陣實驗確立了除8號小鼠外的血清最佳包被濃度及稀釋度。除4號鼠外(10 ng/mL)，其余最佳包被濃度為20 ng/mL。4～9號鼠的血清最佳稀釋度分別為1∶1 500、1∶1 500、1∶1 000、1∶6 000、1∶1 500。在最佳包被濃度及稀釋度條件下，間接競爭ELISA法確定5只小鼠血清均能與目的肽特異性結(jié)合，與無關(guān)肽沒有交叉反應(yīng)。其中，4號與7號小鼠靈敏度較高，4號的IC50為15.6 ng/mL，7號的IC50為13.7 ng/mL。

3 討 論

半抗原的設(shè)計和合成，以及效價高、特異性強的抗體的獲得是建立免疫分析方法的關(guān)鍵步驟。半抗原的結(jié)構(gòu)特征與蛋白質(zhì)連接的位點、連接臂的長度，以及偶聯(lián)比的高低均直接影響著抗體的效價和特異性[17-18]。本研究中所合成的肺彈性蛋白降解肽段分子量小，缺乏T細(xì)胞表位而無法直接誘導(dǎo)動物機(jī)體等產(chǎn)生特異性抗體，本身不具有免疫原性。由于其結(jié)構(gòu)本身不具有適用于偶聯(lián)的活性基團(tuán)，如羧基、氨基、巰基等，本實驗通過化學(xué)修飾在肽段一端連接上GGC片段，使其端基為半胱氨酸，借助交聯(lián)劑Sulfo-SMCC與大分子載體蛋白mcKLH結(jié)合成功制備出人工抗原。實驗周期短，操作簡便。紫外掃描和SDS-PAGE電泳確認(rèn)了該人工抗原合成成功，其蛋白濃度為1.181 mg/mL，抗血清效價高于1∶64 000，IC50為13.7 ng/mL，且抗血清與無關(guān)肽段無交叉反應(yīng)。間接競爭ELISA法初步證明抗血清具備效價高，特異性強等特點，為建立快速準(zhǔn)確檢測COPD免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

[1]楊暢，馮燕，王新衛(wèi)，等．慢性阻塞性肺疾病患者頸動脈彈性相關(guān)參數(shù)分析[J]．中國全科醫(yī)學(xué)，2013，16(1)：47-49．

[2]蔡映云．慢性阻塞性肺疾病[M]．北京：科學(xué)出版社，2010：165-180．

[3]任笑蒙，韓曉男，張旭晨，等．彈性蛋白酶肺氣腫表面活性物質(zhì)蛋白A、B的基因表達(dá)[J]．醫(yī)學(xué)研究通訊，2001，2(2)：6-10．

[4]He J,Turino GM,Lin YY.Characterization of peptide fragments from lung elastin degradation in chronic obstructive pulmonary disease[J].Exp Lung Res,2010,36(9):548-557.

[5]盧希勤，施海燕，王鳴華．甲氰菊酯人工抗原的合成和鑒定[J]．免疫學(xué)雜志，2009，5(3)：346-348．

[6]Barroso B,Abello N,Bischoff R.Study of human lung elastin degradation by different elastases using high-performance liquid chromatography/mass spectrometry[J].Anal Biochem,2006,358(2):216-224.

[7]Brusselle GG,Joos GF,Bracke KR．New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease[J].Lancet,2011,378(9795):1015-1026．

[8]宋娟，王榕妹，王悅秋，等．半抗原的設(shè)計、修飾及人工抗原的制備[J]．分析化學(xué)，2010，38(8)：1211-1218．

[9]萬巍巍，張換敬，葉輝銘，等．25-羥基維生素D3人工完全抗原的合成與鑒定[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27(11)：1173-1175,1179．

[10]韓盈盈，李小兵，劉國文，等．重金屬鎘離子人工抗原的合成與鑒定[J]．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35(2)：188-191．

[11]鄧省亮，李平，邱靜，等．雙烯雌酚人工抗原的合成及特異性抗體的制備[J]．免疫學(xué)雜志，2011，3(3)：250-253,258．

[12]Kong T,Liu GW,Li XB,et al.Synthesis and identification of artificial antigens for cadmium and copper[J].Food Chem,2010,123(4):1204-1209.

[13]Sui K,Pan JR,Wang L,et al.Synthesis and identification of generic antigen for ether pyrethroid pesticides[J].Chinese J Anal Chem,2012,40(8):1274-1278.

[14]Yang TT,Zhao CC,Shen XP,et al.Synthesis and identification of hapten and complete antigen of norketa mine[J].Chinese J Anal Chem,2010,38(1):109-112.

[15]Cao H,Ji F,Wang XY,et al.Synthesis and identification of the hapten and complete antigens for Zearalenone[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2011,27(9):975-978.

[16]Zhu GN,Gui WJ,Zheng ZT,et al.Synthesis and identification of artificial antigen for imidacloprid[J].Agri Sci China,2006,5(4):307-312.

[17]Cui Y,Zhang H,Ma Y,et al.Synthesis and identification of artificial antigens for sulfaguanidine and sulfathiazole[J].Wei Sheng Yan Jiu,2010,39(4):440-443.

[18]Liu B,Perepelov AV,Svensson MV,et al.Genetic and structural relationships of Salmonella O55 and Escherichia coli O103 O-antigens and identification of a 3-hydroxybutanoyltransferase gene involved in the synthesis of a Fuc3N derivative[J].Glycobiology,2010,20(6):679-688.

統(tǒng)計資料類型

統(tǒng)計資料共有三種類型：計量資料、計數(shù)資料和等級資料。按變量值性質(zhì)可將統(tǒng)計資料分為定量資料和定性資料。

定量資料又稱計量資料，指通過度量衡的方法，測量每一個觀察單位的某項研究指標(biāo)的量的大小，得到的一系列數(shù)據(jù)資料，其特點為具有度量衡單位、多為連續(xù)性資料、可通過測量得到，如身高、紅細(xì)胞計數(shù)、某一物質(zhì)在人體內(nèi)的濃度等有一定單位的資料。

定性資料分為計數(shù)資料和等級資料。計數(shù)資料為將全體觀測單位(受試對象)按某種性質(zhì)或特征分組，然后分別清點各組觀察單位(受試對象)的個數(shù)，其特點是沒有度量衡單位，多為間斷性資料，如某研究根據(jù)患者性別將受試對象分為男性組和女性組，男性組有72例，女性組有70例，即為計數(shù)資料。等級資料是介于計量資料和計數(shù)資料之間的一種資料，可通過半定量的方法測量，其特點是每一個觀察單位(受試對象)沒有確切值，各組之間僅有性質(zhì)上的差別或程度上的不同，如根據(jù)某種藥物的治療效果，將患者分為治愈、好轉(zhuǎn)、無效或死亡。

Synthesis and identification of artificial antigens of lung elastin degradation peptide*

PengFangyi1,2,CuiYuhua1，MaMingyan2，LiYuankuan2,WuHongyu2，JiangHairong1△,ZhouHuan1

(1.PharmaceuticalEngineeringSpecialty,SchoolofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology，Chongqing400054，China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,DianjiangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dianjiang,Chongqing408300,China)

Objective To synthesize and identify artificial antigens of lung elastin degradation peptide and for the purpose of preparation of COPD test.MethodsThe artificial antigens were synthesized by Sulfo-SMCC and KLH.The complete antigens were identified by ultraviolet spectrum and SDS-PAGE.Immunize Balb/c mice was used to prepare antibody.The antiserum activity was evaluated by indirect competitive ELISA.ResultsThe artificial antigens were identified by ultraviolet spectrum and SDS-PAGE.The protein concentration was 1.181 mg/mL.The titer of antiserum was 1∶64 000,and IC50 was 13.7 ng/mL.The antiserum had no cross-reaction with nonsense peptide.ConclusionThe artificial antigens were acquired successfully,which had good immunogenicity.The Results have laid basis for COPD test.

lung elastin degradation peptide;artificial antigens;antibody

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.22.004

國家自然科學(xué)基金資助項目(30571714,60873103)；重慶市科委自然基金(CSTC,2008BB5331,2009BB7231);重慶市衛(wèi)生局科研項目(2012-2-383)。

彭方毅(1970-)，主任檢驗師，博士，主要從事免疫學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:r0102@cqut.edu.cn。

R392-33

A

1671-8348(2015)22-3037-03

2015-02-08

2015-07-10)