楊成萬，高 霞，周鐵軍，張 強

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理教研室，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

TGF-β1對人子宮頸腺癌Hela細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

楊成萬，高 霞，周鐵軍，張 強

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理教研室，四川瀘州 646000)

目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對宮頸腺癌Hela細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法體外培養(yǎng)人宮頸腺癌Hela細(xì)胞。對照組：用不含TGF-β1的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞。試驗組：用不同濃度TGF-β1(0.01、0.10、1.00、10.00 ng/mL)刺激Hela細(xì)胞。在刺激后不同時間點用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)變化，并用半定量 RT-PCR法和細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法分別檢測細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin、Vimentin 的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組相比，不同濃度TGF-β1刺激Hela細(xì)胞48 h時開始出現(xiàn)形態(tài)變化，刺激72 h 后變化更明顯，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)；半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，Hela細(xì)胞的上皮標(biāo)記物E-cadherin mRNA表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin mRNA表達(dá)上調(diào)且均呈濃度依賴性，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后，隨著TGF-β1濃度的增加E-cadherin蛋白的表達(dá)逐漸降低，Vimentin蛋白的表達(dá)則逐漸升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TGF-β1可誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

宮頸腫瘤；轉(zhuǎn)化生長因子β1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，組織學(xué)類型以鱗狀細(xì)胞癌居多，近20年來宮頸腺癌的發(fā)病率成倍增長且趨于年輕化[1]。目前，對宮頸腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)尚未完全清楚。已有研究證實轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)介導(dǎo)了多種惡性腫瘤如肺癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、食管癌等發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[2-5]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。但TGF-β1是否介導(dǎo)宮頸腺癌發(fā)生EMT的相關(guān)報道很少。本試驗擬通過體外培養(yǎng)的人宮頸腺癌Hela細(xì)胞，研究TGF-β1是否能誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而為闡明宮頸腺癌浸潤轉(zhuǎn)移機制奠定基礎(chǔ)，為宮頸腺癌的治療提供了新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人宮頸腺癌Hela細(xì)胞株由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。

1.1.2 主要試驗試劑 DMEM高糖型培養(yǎng)液[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]；胎牛血清(FBS，深圳賽泰克生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶溶液(上海生化公司)；人重組TGF-β1(Peprotech公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；總RNA提取試劑盒，DNA Marker Ⅰ，2×Taq PCR MasterMix(北京天根科技有限公司)；RT-PCR試劑盒(成都博瑞克生物技術(shù)有限公司)；PCR引物(生工生物工程有限公司)；兔抗人E-cadherin多克隆抗體，鼠抗人Vimentin 單克隆抗體(基因科技上海有限公司)；Envision兩步法試劑盒，濃縮型DAB試劑盒(中杉金橋公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 CO2細(xì)胞電熱恒溫培養(yǎng)箱(HEPA class100型，Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(TS100-F100型，德國Leica公司)，PCR擴增儀(TC-512型，英國Techne公司)，凝膠掃描成像儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 人子宮頸腺癌Hela細(xì)胞的培養(yǎng) 人子宮頸腺癌Hela細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下用含有10%FBS、1 mL青鏈霉素、DMEM高糖型培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞生長達(dá)到約80.00%融合時，即可用0.25%胰蛋白酶消化溶液進(jìn)行細(xì)胞消化傳代。傳代3次后，細(xì)胞達(dá)到約80.00%融合，生長狀況良好時，即可用于試驗。

1.2.2 TGF-β1刺激人子宮頸腺癌Hela細(xì)胞后的形態(tài)觀察 對照組：不加TGF-β1的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Hela細(xì)胞。試驗組：將Hela細(xì)胞傳代于6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長到融合度約50%～60%時，換成分別含有0.01、0.10、1.00、10.00 ng/mL TGF-β1(分別為T1、T2、T3、T4組)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，期間每天換液1次。并于24、48、72 h取出6孔板在倒置顯微鏡下觀察和拍攝細(xì)胞的生長形態(tài)。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測E-cadherin及Vimentin mRNA表達(dá)變化 各組細(xì)胞不同濃度(0、0.01、0.10、1.00、10.00 ng/mL)TGF-β1刺激72 h后，按Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA；配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將所得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)原液置于-20 ℃中保存；按PCR試劑盒說明書配制PCR擴增反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，檢測相關(guān)基因的表達(dá)量，各引物序列見表1。E-cadherin按以下反應(yīng)程序反應(yīng)：預(yù)變性，94 ℃，3 min；變性，94 ℃，30 s；退火，53 ℃，30 s；延伸，72 ℃，20 s，30個循環(huán)；終末延伸，72 ℃，3 min；4 ℃保存。Vimentin按以下反應(yīng)程序反應(yīng)：預(yù)變性，94 ℃，3 min；變性，94 ℃，30 s；退火，56 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s，30個循環(huán)；終末延伸，72 ℃，3 min；4 ℃保存。對PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠掃描成像系統(tǒng)檢測電泳結(jié)果，照相，與內(nèi)參的吸光值比較，并計算各組細(xì)胞的mRNA的相對含量。

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測E-cadherin及Vimentin蛋白的表達(dá)變化 收集對數(shù)期生長的Hela細(xì)胞，消化，計數(shù)將細(xì)胞密度調(diào)整為3.5×105個/mL，接種于6孔板中預(yù)置的載玻片上。至細(xì)胞生長融合度約為孔底的50%～60%，吸出原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，換成分別含有0、0.01、0.10、1.00、10.00 ng/mL TGF-β1的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，取出細(xì)胞爬片，PBS緩沖液漂洗、室溫下4%多聚甲醛固定30 min。滴加一抗E-cadherin(稀釋比例1∶100)、Vimentin(稀釋比例1∶100)，室溫孵育2 h，滴加A液，室溫孵育30 min，滴加現(xiàn)配好的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件分析，對每張爬片隨機攝像5幀，檢測其陽性細(xì)胞的平均光密度值[IOD /(N×area)]，然后取平均光密度值的均值。

2 結(jié) 果

2.1 人宮頸腺癌Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡下觀察，對照組中人宮頸腺癌Hela細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，細(xì)胞形態(tài)為多邊形或立方形，細(xì)胞分布呈鋪路石樣，為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)(圖1A)，培養(yǎng)72 h后形態(tài)變化不大(圖1B)；T4組在加入TGF-β1 0 h或24 h時與對照組相比形態(tài)未發(fā)生明顯變化(圖1C)；刺激48 h 時形態(tài)開始出現(xiàn)變化，細(xì)胞伸出許多小突出，部分失去多邊形或立方形形態(tài)變?yōu)樗笮危淮碳?2 h 后變化更明顯，試驗組較對照組大部分細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞拉長呈梭形或紡錘形，細(xì)胞的間隙變寬，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接變得松散(圖1D)。

表1 引物堿基序列

A：對照組0 h；B：對照組72 h；C：TGF-β1 10.00 ng/mL 0 h；D：TGF-β1 10.00 ng/mL 72 h。

圖1 TGF-β1對人宮頸腺癌Hela細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

2.2 半定量RT-PCR檢測TGF-β1刺激人宮頸腺癌Hela細(xì)胞株后E-cadherin，Vimentin mRNA表達(dá)的變化 E-cadherin mRNA的表達(dá)隨TGF-β1濃度的增加表達(dá)量逐漸下降，在TGF-β1 10.00 ng/mL濃度時下降最明顯，Vimentin mRNA的表達(dá)則隨著TGF-β1濃度的增加表達(dá)量逐漸增高，在TGF-β1 10.00 ng/mL濃度時升高最明顯。不同TGF-β1濃度組中E-cadherin，Vimentin mRNA的表達(dá)與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，見表2，圖2。

表2 TGF-β1對人宮頸腺癌Hela細(xì)胞E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的影響

續(xù)表2 TGF-β1對人宮頸腺癌Hela細(xì)胞E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)的影響

2.3 細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測TGF-β1刺激人宮頸腺癌Hela細(xì)胞后E-cadherin、Vimentin的表達(dá)變化 E-cadherin免疫反應(yīng)陽性顆粒主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。在TGF-β1刺激Hela細(xì)胞72 h時，隨著TGF-β1濃度的升高，E-cadherin陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(圖3)；Vimentin蛋白表達(dá)陽性顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，隨著TGF-β1濃度的增加，Vimentin陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多(圖4)。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：E-cadherin蛋白的表達(dá)在72 h 時間點，各組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著TGF-β1濃度的增加，E-cadherin陽性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度值逐漸減少；Vimentin蛋白表達(dá)隨著TGF-β1濃度的增加，其平均光密度值則逐漸增加。各組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

圖2 TGF-β1對Hela細(xì)胞E-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)的影響

A：TGF-β1 0 ng/mL；B：TGF-β1 0.10 ng/mL；C：TGF-β1 10.00 ng/mL。

圖3 TGF-β1對人宮頸腺癌Hela細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響(Envision×400)

A：TGF-β1 0 ng/mL；B：TGF-β1 0.10 ng/mL；C：TGF-β1 10.00 ng/mL。

圖4 TGF-β1對人宮頸腺癌Hela細(xì)胞Vimentin表達(dá)的影響(Envision ×400)

表3 TGF-β1對人宮頸腺癌Hela細(xì)胞E-cadherin及Vimentin表達(dá)的影響

3 討 論

目前，研究發(fā)現(xiàn)上皮源性惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移大多數(shù)與腫瘤獲得EMT特征有關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞失去其上皮特性,獲得間質(zhì)特征的過程。EMT不但參與了某些生理過程如胚胎和器官發(fā)育、組織重建、創(chuàng)傷愈合等，而且還參與了某些病理過程，如組織纖維化和促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[6]。EMT主要特點包括以下方面：(1)上皮細(xì)胞形態(tài)改變，極性消失，細(xì)胞黏附力下降，部分細(xì)胞可伸出偽足遷移和運動力增強；(2)上皮性標(biāo)志物，如E-cadherin等表達(dá)下調(diào)；(3)間葉表型的獲得，如Vimentin等表達(dá)上調(diào)。E-cadherin被認(rèn)為是EMT的上皮性的標(biāo)志性蛋白[7]。E-cadherin表達(dá)的減少或功能的缺失，是上皮細(xì)胞緊密連接的破壞及腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲的重要因素[8]。E-cadherin表達(dá)的下調(diào)或缺失是EMT的典型特征，其在多種上皮性惡性腫瘤中已被證實，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等[9-12]。Vimentin即波形蛋白是一種中間絲蛋白，廣泛存在于間充質(zhì)細(xì)胞中，在上皮細(xì)胞中極少表達(dá)，是間質(zhì)細(xì)胞一個重要的分子標(biāo)記，其在上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)陽性或增高提示可能發(fā)生了EMT，試驗證明Vimentin在前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)和該腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[13-14]。申震等[15]報道用免疫組織化學(xué)的方法檢測子宮頸鱗癌組織中E-Cadherin、Vimentin 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，隨著子宮頸鱗癌惡性程度的升高，E-Cadherin 的表達(dá)逐漸減少，Vimentin 表達(dá)增多，初步證實了子宮頸鱗癌侵襲生長過程中存在EMT 現(xiàn)象。

TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，目前已有大量試驗證實其為EMT發(fā)生的主要誘導(dǎo)劑。張慧君等[16]報道人肺腺癌PC9細(xì)胞在TGF-β1作用下，細(xì)胞形態(tài)拉長，呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間連接也變得松散。蔡成等[17]報道TGF-β1作用胃癌KATO-Ⅲ細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)轉(zhuǎn)變。李婷芬等[18]報道用2 ng/mL TGF-β1刺激人肝HL7702細(xì)胞72 h后，細(xì)胞形態(tài)拉長變成紡錘形，細(xì)胞間隙變大。本試驗研究結(jié)果顯示：用不同濃度TGF-β1刺激人宮頸腺癌Hela細(xì)胞24 h時，其細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化；刺激48 h 時，Hela細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化，伸出許多小突出，部分失去多邊形或立方形形態(tài)變?yōu)樗笮?；刺?2 h后，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞拉長呈梭形或紡錘形，細(xì)胞的間隙變寬，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接變得松散。說明TGF-β1誘導(dǎo)人宮頸腺癌Hela細(xì)胞發(fā)生EMT的形態(tài)變化，且與TGF-β1作用時間有關(guān)。

為了進(jìn)一步證實經(jīng)TGF-β1處理的人宮頸腺癌Hela細(xì)胞可發(fā)生EMT，本試驗選擇用TGF-β1刺激人Hela細(xì)胞培養(yǎng)72 h，通過半定量RT-PCR和細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測EMT相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)情況。本試驗證明：從細(xì)胞形態(tài)、基因和蛋白水平TGF-β1可誘導(dǎo)宮頸腺癌Hela細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且具有TGF-β1刺激時間和濃度依賴性。

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[16]張慧君，張雷，王和勇，等．TGF-beta1誘導(dǎo)人肺腺癌PC9細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究[J]．中國肺癌雜志，2010，13(1)：34-37．

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[18]李婷芬，王冰瑩，嚴(yán)永敏，等．TGF-β1誘導(dǎo)人肝HL7702細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究[J]．江蘇大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，22(2)：93-96．

Effect of TGF-β1 on epithelial-mesenchyme transition in Hela cells of human cervical cancer*

YangChengwan，GaoXia,ZhouTiejun，ZhangQiang

(DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To investigate the effect of TGF-β1 on epithelial mesenchymal transition in Hela cells of human cervical cancer.MethodsHela cells of Human cervical cancer cultured in vitro were divided into the experimental group and control group.In the control group,Hela cells were cultured in serum-free medium without TGF-β1.In the experimental group,Hela cells were treated with different concentrations of TGF-β1 (0.01,0.10,1.00,10.00 ng/mL).The morphological changes of Hela cells of human cervical cancer were stimulated by TGF-β1 at different time points observed under an inverted microscope,while the expressions of mRNA and protein of E-cadherin and Vimentin in Hela cells were detected by semi-quantitative RT-PCR assay and cellular immunohistochemistry respectively.ResultsComparing with the control group,Hela cells stimulated by TGF-β1 for 48 h began to have morphological changes.Mesenchymal morphology changes were observed obviously after 72 h.RT-PCR analysis showed that the expression of epithelial marker E-cadherin mRNA was down regulated,while the expression of mesenchymal marker Vimentin mRNA was increased and showed a concentration dependence after the stimulation of TGF-β1,Comparing with the control group,the difference was statistically significant (P<0.05).After stimulation of TGF-β1 in Hela cells,cellular immunohistochemistry showed that the concentration of TGF-β1 increased,the expression of E-cadherin protein gradually decreased,and the expression of Vimentin protein gradually increased at the same time.Comparing with the control group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionTGF-β1 may induce epithelial mesenchymal transformation in Hela cells of human cervical cancer.

uterine cervical neoplasms;TGF-β1;epithelial mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.22.002

四川省教育廳科研基金項目(09ZA178)。

楊成萬(1969-)，副教授，碩士，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

R737.3

A

1671-8348(2015)22-3030-04

2015-02-08

2015-07-09)