馮 潛，石世代，周 勇，李恩亮，吳榮壽，李科浩，鄔林泉

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，南昌 330006)

·論 著·

KLF4調(diào)控MMP9對原發(fā)性肝癌的侵襲遷移能力的影響*

馮 潛，石世代，周 勇，李恩亮，吳榮壽，李科浩，鄔林泉△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，南昌 330006)

目的 研究Krüppel 樣因子 4(KLF4)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)情況，探討KLF4調(diào)節(jié)MMP9對原發(fā)性肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。方法收集原發(fā)性肝癌手術(shù)患者癌和癌旁組織標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)、實(shí)時熒光定量PCR和免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測50例肝癌組織及對應(yīng)癌旁組織中KLF4和MMP9的表達(dá)情況；構(gòu)建重組質(zhì)粒，上調(diào)肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞系)的KLF4表達(dá)，檢測MMP9 mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞運(yùn)用Transwell侵襲試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)觀察侵襲和遷移能力的變化。結(jié)果相比癌旁組織，KLF4在肝癌組織中的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而MMP9的表達(dá)明顯增高(P<0.05)。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，上調(diào)KLF4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP9的mRNA 和蛋白表達(dá)均降低，并影響HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)論在原發(fā)性肝癌中，KLF4低表達(dá)，而MMP9高表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中上調(diào)KLF4表達(dá)可引起MMP9表達(dá)下降，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

KLF4；基質(zhì)金屬蛋白酶9；肝腫瘤；侵襲；遷移

原發(fā)性肝細(xì)胞癌簡稱肝癌，是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一。盡管早期診斷和治療方案已有改善，但仍不能改變肝癌預(yù)后不良的結(jié)果。擴(kuò)散和腫瘤侵襲、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。研究表明多種基因的轉(zhuǎn)錄過程中都有Krüppel 樣因子4(KLF4)參與，起激活或抑制的作用，多種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖，KLF4可以調(diào)節(jié)發(fā)育分化、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以減少解除所有其他細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的降解多糖，平衡可損傷矩陣，然后加速學(xué)習(xí)障礙癌細(xì)胞突破組織、癌旁組織及其他組織侵襲和轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處。然而，KLF4與MMP9 兩者在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)系尚不清楚，因此本試驗(yàn)主要探討肝癌細(xì)胞中KLF4通過調(diào)控MMP9對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院行原發(fā)性肝癌切除術(shù)患者的肝癌及癌旁組織標(biāo)本各50例。所有患者術(shù)前均未接受放化療。其中男32例，女18例，年齡45～66歲，平均(54.2±2.9)歲，樣品采集后立即在液氮中保存，并經(jīng)病理證實(shí)?；颊呔橥?，南昌大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)試劑及器具 RNA提取試劑(Invitrogen公司)；蛋白抽提試劑盒(普利萊)；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA連接酶；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小、大提取試劑盒；DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生物公司)；β-actin(Proteintech公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR分析儀7500(ABI公司)；BCA法蛋白測定試劑盒(碧云天公司)；MMP9、KLF4一抗(Proteintech公司)；山羊抗兔二抗(康為世紀(jì)公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco)；設(shè)計的KLF4序列及相關(guān)引物由上海生工公司合成；pcDNA3.1(+)質(zhì)粒、過表達(dá)KLF4質(zhì)粒和HepG2細(xì)胞由江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 將收集的肝癌患者的癌組織和癌旁組織在福爾馬林中固定，石蠟包埋。制成石蠟切片后烤片，3%雙氧水室溫孵育消除過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖(PBS)溶液沖洗3次，5%胎牛血清孵育20 min，加入一抗，37 ℃ 孵育2 h，PBS溶液沖洗3次。再加入二抗，在37 ℃條件下孵育30 min，PBS溶液沖洗3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記生物素，37 ℃孵育30 min，PBS溶液沖洗3次。每一張切片滴加1滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液，顯色。用自來水充分沖洗，染色，脫水，透明，封片。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5%CO2條件下，HepG2細(xì)胞在用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時使用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行，在轉(zhuǎn)染6 h后改換含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，提取細(xì)胞中的總RNA和總蛋白。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時熒光定量PCR檢測；獲得的蛋白質(zhì)行蛋白免疫印跡(Western blot)檢測。

1.2.4 RNA的提取及其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 研磨收集新鮮的肝癌組織和癌旁組織，移到焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過后的EP管中，向EP管中加有1 mL Trizol反復(fù)吹打，靜置5 min后加入氯仿0.2 mL，充分混勻后室溫靜置5 min后12 000×g離心15 min，小心吸取上層透明液體，千萬不能觸及紅色液體以免污染獲得RNA。向獲得的上層透明液體中加入0.5 mL異丙醇，靜置15 min，12 000×g離心15 min，棄上清液，加無水乙醇1 mL混勻，12 000×g離心10 min，棄上清液，放置在通風(fēng)處使得EP管中的無水乙醇揮發(fā)，DEPC水溶解。提取的RNA的完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，-80 ℃條件下保存。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測KLF4和MMP9的mRNA的表達(dá) 首先提取肝癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中總RNA，將提取的組織中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，45 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。運(yùn)用SYBR Green法檢測KLF4和MMP9的表達(dá)情況，運(yùn)用的反應(yīng)條件為：94 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)40次；最后72 ℃延伸7 min。每組樣品重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計分析肝癌患者的癌組織和癌旁組織中KLF4和MMP9 mRNA的表達(dá)。其次，將HepG2細(xì)胞分成：空白對照組、過表達(dá)KLF4組和無效處理組3組，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，用SYBR GreenⅠ法，在ABI PRISM 7500自動熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢查MMP9的mRNA表達(dá)水平，每個樣品均做3個復(fù)孔，設(shè)定閾值，測定平均的Ct值。

1.2.6 構(gòu)建過表達(dá)KLF4質(zhì)粒 通過Pubmed查找KLF4基因的序列，引物根據(jù)Genebank 中KLF4 mRNA序列設(shè)計引物。其上游引物：5′-CGC GGA TCC ATG AGC AGC CAC CTG GCG AGT C-3′；下游引物：5′-CCG CTC GAG TCA TTA AAA ATG CCT CTT CAT GTG T-3′。通過Primestar方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增KLF4基因片段，獲得的KLF4基因的片段用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線觀察目的條帶，進(jìn)行膠回收，靶基因恢復(fù)KLF4和質(zhì)粒DNA的T4 DNA連接酶相同的酶切連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂層板，重組質(zhì)粒的篩選，質(zhì)粒提取后測序驗(yàn)證。

1.2.7 Western blot檢測KLF4和MMP9蛋白的表達(dá)情況 通過蛋白裂解液法收集肝癌組織和癌旁組織蛋白，通過BCA法檢測獲得蛋白的濃度，通過Western blot檢測收集的50例肝癌組織和癌旁組織中的KLF4和MMP9的表達(dá)情況。統(tǒng)計分析肝癌患者的癌組織和癌旁組織中KLF4和MMP9的表達(dá)情況。肝癌細(xì)胞上調(diào)KLF4后通過Western blot檢測MMP9的表達(dá)情況。在HepG2細(xì)胞對數(shù)期時進(jìn)行轉(zhuǎn)染過表達(dá)KLF4的質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后提取HepG2的蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，取等量50 μg蛋白質(zhì)樣品煮沸10 min后，配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，然后分別結(jié)合對應(yīng)KLF4、MMP9的一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后利用化學(xué)發(fā)光法觀察KLF4和MMP9表達(dá)情況。

1.2.8 Transwell侵襲試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力 (1)Transwell試驗(yàn)：培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)期后進(jìn)行轉(zhuǎn)染KLF4至HepG2細(xì)胞中，24 h后用胰酶進(jìn)行消化，將消化下來的細(xì)胞按2×104細(xì)胞數(shù)加入每個Transwell小室，用無血清的培養(yǎng)液在小室上面進(jìn)行培養(yǎng)后，24孔板放置在含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2孵育24 h，10 min甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，上非遷移的細(xì)胞用棉簽輕輕擦拭，仔細(xì)地用PBS溶液洗3次。顯微鏡下觀察細(xì)胞，計數(shù)。(2)劃痕試驗(yàn)：培養(yǎng)細(xì)胞至均勻成單層鋪滿于每孔后進(jìn)行轉(zhuǎn)染KLF4至HepG2細(xì)胞中，24 h后用相同大小槍頭進(jìn)行劃痕，每孔劃痕粗細(xì)均勻，PBS清洗細(xì)胞，培養(yǎng)液為37 ℃、血清游離5%的CO2，細(xì)胞培養(yǎng)基中觀察劃痕愈合情況，拍下0、12、24 h后在倒置顯微鏡下比較。

2 結(jié) 果

2.1 KLF4與MMP9 mRNA及蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 實(shí)時熒光定量PCR檢測50例肝癌患者癌和癌旁組織中KLF4和MMP9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織KLF4 mRNA明顯低于相對應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)；MMP9 mRNA的表達(dá)明顯高于相對應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。Western blot結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證肝癌組織中KLF4蛋白表達(dá)低于相對應(yīng)的癌旁組織，MMP9蛋白表達(dá)高于相對應(yīng)的癌旁組織(圖1C)。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測KLF4和MMP9在肝癌組織中的表達(dá)情況 通過免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF4蛋白在76%(38/50)的病例肝癌組織呈低表達(dá)，而僅有10%(5/50)的癌旁組織中呈低表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MMP9 蛋白在84%(42/50)的病例肝癌組織呈高表達(dá)，而僅有12%(6/50)的癌旁組織中呈高表達(dá)，兩者差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

2.3 過表達(dá)KLF4對MMP9表達(dá)的影響 實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4組中KLF4 mRNA 和蛋白的表達(dá)較空白對照組和無效處理組明顯升高(P<0.05)，而空白對照組、無效處理組之間KLF4 mRNA 表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另外，MMP9 mRNA表達(dá)量隨著KLF4表達(dá)的升高而降低。說明降低KLF4可以抑制MMP9的表達(dá)(圖4)。

A:KLF4 mRNA表達(dá)水平；B.MMP9 mRNA表達(dá)水平；C.KLF4與MMP9蛋白表達(dá)水平。*：P<0.05，與癌旁組織比較。

圖1 KLF4與MMP9蛋白及mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

A:KLF4在肝癌組織中的表達(dá)；B:KLF4在癌旁組織中的表達(dá)。

圖2 KLF4在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)(×400)

2.4 KLF4調(diào)節(jié)MMP9對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示：過表達(dá)KLF4組細(xì)胞侵襲能力較空白對照組和無效處理組明顯降低(P<0.05)(圖5)。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示：過表達(dá)KLF4組HepG2細(xì)胞的劃痕愈合率比空白對照組和無效處理組細(xì)胞劃痕愈合率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

A:肝癌組織；B:癌旁組織。

圖3 MMP9在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)(×400)

A:過表達(dá)KLF4 mRNA表達(dá)水平；B:過表達(dá)KLF4后MMP9 mRNA表達(dá)水平；C:過表達(dá)KLF4后KLF4及MMP9蛋白表達(dá)水平。*：P<0.05，與空白對照組、無效處理組比較。

圖4 3組KLF4和MMP9 的mRNA 和蛋白水平的變化

A:空白對照組；B:無效處理組；C：過表達(dá)KLF4組；D：3組侵襲細(xì)胞數(shù)比較。*：P<0.05，與空白對照組、無效處理組比較。

圖5 KLF4調(diào)節(jié)MMP9對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)

圖6 過表達(dá)KLF4的HepG2細(xì)胞與空白對照組和無效處理組HepG2細(xì)胞遷移能力的比較(×400)

3 討 論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)一種嚴(yán)重威脅人類生命安全的惡性腫瘤，也是一種發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在癌癥病死率中排第3，每年新增加患者約600萬[1]，雖然近年對肝癌的認(rèn)識加深，早期診斷和治療方法有了進(jìn)一步提高，但總體效果仍然是很有限的，最關(guān)鍵就在于對腫瘤的侵襲、肝內(nèi)擴(kuò)散及肝外轉(zhuǎn)移很難控制。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，步驟多、階段多、參與基因多。以分子水平角度可以分為以下過程：(1)原發(fā)腫瘤細(xì)胞的生長與增殖；(2)黏附分子介導(dǎo)癌細(xì)胞與細(xì)胞外黏附；(3)癌細(xì)胞釋放多種蛋白水解酶水解細(xì)胞外基質(zhì)、基膜；(4)通過間隙組織損傷局部浸潤或水解血管和淋巴癌細(xì)胞發(fā)展到其他組織；(5)新生的微血管在腫瘤組織中形成；(6)腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊在新的微環(huán)境中得到成長后，增殖。其每一個過程中均受到多個基因或蛋白的精確調(diào)控。

KLF4是在1996年被發(fā)現(xiàn)的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，以前被命名為GKLF，因其在胃腸道組織中高表達(dá)而被發(fā)現(xiàn)命名。KLF4和Spl/ Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族是密切相關(guān)的，是家庭的一員，其作為一種重要的蛋白質(zhì)存在與各種組織和細(xì)胞在體內(nèi)，并與腫瘤等多種疾病有關(guān)[2-3]。KLF4 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在不同的細(xì)胞背景下呈現(xiàn)出不同的功能，結(jié)腸癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌中是起到抑癌作用[4-11]。Yori和Zhang等[12-13]認(rèn)為胃癌細(xì)胞中，高表達(dá)KLF4能夠?qū)е逻w移、侵襲能力下降。因此，在影響細(xì)胞生物學(xué)行為時，KLF4 基因的表達(dá)調(diào)節(jié)和功能改變起著重要作用。

在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管形成中Ca2+、Zn2+依賴的內(nèi)源性蛋白酶家族MMPs起著重要的作用。MMPs可以降解ECM和血管基底膜,在腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜中發(fā)揮水解蛋白的作用[14]。明膠酶MMP9和MMP2作為MMPs成員,尤其被關(guān)注。Chen等[15]對143例肝癌組織標(biāo)本中的MMP9和MMP2表達(dá)水平的臨床意義進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高侵襲力肝癌細(xì)胞株中MMP9的表達(dá)顯著上調(diào)。在一項動物實(shí)驗(yàn)中,阻斷MMP9的功能可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移中MMP9的作用已得到認(rèn)可。多種生長因子,包括轉(zhuǎn)化生長固子P(TGF-P)、上皮生長因子(EGF)和類胰島表1號增長因子(IGF-I)能夠通過激活MMP9提高癌細(xì)胞的侵襲力[16-17]。上述研究表明MMP9 在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)MMP9在肝癌組織中過表達(dá)，但是KLF4與MMP9共表達(dá)在肝癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。

Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)KLF4在肝癌中是起到抑癌的作用，且對肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移起到抑制的作用，MMP9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用也得到廣泛認(rèn)同。本研究首次分析KLF4與MMP9蛋白在肝癌組織中表達(dá)的關(guān)聯(lián)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF4與MMP9蛋白在肝癌組織中表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性。另外，在肝癌細(xì)胞HepG2 中過表達(dá)KLF4后MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低。上述結(jié)果表明KLF4可特異性調(diào)控MMP9的表達(dá)。同時本研究還發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞HepG2中過表達(dá)KLF4后，肝癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯減弱。上述結(jié)果表明KLF4通過調(diào)控MMP9的表達(dá)可以影響肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究證實(shí)在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中過表達(dá)KLF4可以降低MMP9的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。目前，本課題組正在深入尋找肝癌細(xì)胞中KLF4調(diào)控MMP9的具體分子生物學(xué)機(jī)制，可能為原發(fā)性肝癌的治療提供新思路。

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The effect of KLF4 on invasion and migration by regulating MMP9 in hepatocellular carcinoma*

FengQian，ShiShidai，ZhouYong，LiEnliang，WuRongshou，LiKehao，WuLinquan△

(DepartmentofHepatobiliarySurgery，SecondAffiliatedHospital，NanchangUniversity，Nanchang,Jiangxi330006，China)

Objective To investigate the effects of Krüppel like factor 4 (KLF4) on matrix metalloproteinase 9 (MMP9) expression in hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsA total of 50 primary hepatocellular carcinoma samples and their corresponding adjacent tissues specimens were collected.The expression of KLF4 and MMP9 were detected by IHC,Western blot and qRT-PCR.After KLF4 gene was transfected into hepatocellular carcinoma cell line(HepG2 cell line),the expressions of KLF4 and MMP9 were conformed by qRT-PCR and Western blot.Migration and invasion of HepG2 cell line transfected by KLF4 were detected by wound-healing assay and invasion assay.ResultsCompared to corresponding adjacent tissues,The expression of KLF4 was significantly lower in HCCs(P<0.05),and MMP9 expression was remarkably higher in HCCs(P<0.05).KLF4 over-expression inhibited the expression of MMP9 on the protein and mRNA levels.Wound-healing assay and invasion assay confirmed that KLF4 regulated cell invasion and migration through regulating MMP9 expression.ConclusionKLF4 showed low expression in HCCs,and MMP9 was overexpressed.Up-regulation of KLF4 could decrease the expression of MMP9 in HepG2 cell line,which inhibited invasion and migration.

KLF4;matrix metalloproteinase 9;liver neoplasms;invasion;migration

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.22.001

江西省教育廳一般項目(GJJ14056)。

馮潛(1987-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肝膽胰外科疾病研究?！?/p>

，E-mail:wlqnc@163.com。

R735.7

A

1671-8348(2015)22-3025-05

2015-02-08

2015-07-08)