陳 偉，涂慧英，李 月△

(1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 400010；2 重慶市墊江縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科 408300)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

3種血小板計(jì)數(shù)方法的比較研究*

陳 偉1，涂慧英2，李 月1△

(1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 400010；2 重慶市墊江縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科 408300)

目的觀察鞘流電阻抗、熒光染色與手工計(jì)數(shù)3種血小板計(jì)數(shù)方法之間的差異。方法收集血小板高值(>500×109/L)85例、中值(100×109/L～300×109/L)211例、低值(<50×109/L)161例，分別在Sysmex XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀CBC+DIFF模式(鞘流電阻抗法)及CBC+RET(熒光染色法)下計(jì)數(shù)血小板，同時(shí)使用改良牛鮑計(jì)數(shù)板進(jìn)行傳統(tǒng)的血小板手工計(jì)數(shù)，比較3種方法所得結(jié)果的差異。結(jié)果觀察所有標(biāo)本在CBC+DIFF模式下，血小板直方圖以及相關(guān)的儀器報(bào)警，陽(yáng)性者手工推片，染色鏡檢血小板形態(tài)。結(jié)論鞘流電阻抗法對(duì)低值和高值血小板的識(shí)別能力不如熒光染色法及手工計(jì)數(shù)，必要時(shí)需用熒光染色法或手工法復(fù)檢，血小板的直方圖以及相關(guān)的儀器報(bào)警陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)推片鏡檢血小板形態(tài)。

血小板；血細(xì)胞分析儀；鞘流電阻抗法；熒光染色法；草酸銨稀釋法

血小板計(jì)數(shù)是血液常規(guī)檢查中的一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)臨床疾病的診斷和治療有極其重要的價(jià)值，與疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。多參數(shù)血細(xì)胞分析儀發(fā)展較快，已廣泛應(yīng)用于臨床。儀器法具有快速、便捷、可檢測(cè)參數(shù)多、精密度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)顯微鏡手工計(jì)數(shù)法的操作繁瑣、耗時(shí)等缺點(diǎn)，一直備受臨床關(guān)注，是目前常規(guī)篩檢血小板的主要方法。但由于儀器檢測(cè)血小板的原理不同，臨床血小板計(jì)數(shù)工作中抗干擾的能力也不盡相同，尤其是現(xiàn)在臨床上需要輸注血小板的患者日益增多，但輸注血小板價(jià)格高，且存在免疫學(xué)輸血反應(yīng)和感染的風(fēng)險(xiǎn)，鑒于此，臨床上迫切需要檢驗(yàn)科提供一個(gè)準(zhǔn)確的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。故本課題探討鞘流電阻抗法、熒光染色法及手工法3種方法檢測(cè)不同數(shù)量血小板的差異，以期獲得檢測(cè)血小板的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2014年2～5月本院住院患者標(biāo)本457例，分3組，其中高值(PLT>500×109/L)85例、中值(100×109/L< PLT<300×109/L)211例、低值(PLT<50×109/L)161例。

1.2 儀器與試劑 Sysmex XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀由日本西森美康公司生產(chǎn)；改良牛鮑氏計(jì)數(shù)板；顯微鏡(奧林巴斯CH20)。試劑和質(zhì)控品均為日本西森美康公司原裝配套產(chǎn)品。草酸銨稀釋液按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版[1]的要求配制。

1.3 方法 每日檢測(cè)標(biāo)本前用XE-2100型血細(xì)胞分析儀原裝配套的質(zhì)控品做質(zhì)控，在控后方可檢測(cè)標(biāo)本。每一份標(biāo)本均在該儀器CBC+DIFF模式及CBC+RET模式下分別檢測(cè)2次，取均值作為最后的測(cè)定值。人工計(jì)數(shù)法：按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版要求用草酸銨稀釋液稀釋樣本后進(jìn)行手工計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)2次取均值。觀察所有標(biāo)本在CBC+DIFF模式下，血小板的直方圖以及相關(guān)的儀器報(bào)警，陽(yáng)性者手工推片，染色鏡檢血小板形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 血小板計(jì)數(shù)結(jié)果 鞘流電阻抗法與熒光染色法在低值組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.31,P=0.021 9<0.05)；鞘流電阻抗法與人工鏡檢比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.41,P=0.018 2<0.05)；而熒光染色法與人工鏡檢比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.18,P=0.861 2>0.05)。中值組比較，兩兩之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.97,P=0.333 8>0.05)。高值組比較，兩兩之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.19,P=0.236 6>0.05)，見表1。

表1 3 組血小板計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 血小板形態(tài)鏡檢結(jié)果 中值部分血小板直方圖大多正常，偶有直方圖出現(xiàn)鋸齒樣下降，推片鏡檢血小板、紅細(xì)胞均無任何異常，究其原因，可能為采血不暢，激活血小板，導(dǎo)致部分血小板少量聚集。

高值血小板的直方圖偶見幾例由于小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片干擾造成的直方圖出現(xiàn)翹尾的異常現(xiàn)象。需注意的是，此時(shí)，患者的平均紅細(xì)胞體積(MCV)并非較低。熒光染色法測(cè)定血小板時(shí)，散點(diǎn)圖明顯異常，異常區(qū)域?yàn)榧t細(xì)胞碎片。用手工計(jì)數(shù)與熒光計(jì)數(shù)血小板就完全避免了小紅細(xì)胞與紅細(xì)胞碎片的影響，后二者計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確。

低值血小板的直方圖出現(xiàn)翹尾、鋸齒樣下降等異常現(xiàn)象較多，鏡檢發(fā)現(xiàn)有以下幾種情形：血小板形態(tài)不規(guī)則，偶有大血小板存在；有小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片存在；采血不暢所致。熒光染色法采用半導(dǎo)體流式細(xì)胞檢測(cè)原理，對(duì)每個(gè)血小板從高低角度二維激光掃描；人工鏡檢采用破壞紅細(xì)胞能力強(qiáng)的草酸銨溶液為稀釋液進(jìn)行稀釋然后鏡檢。故當(dāng)以上的干擾存在時(shí)，手工計(jì)數(shù)與熒光計(jì)數(shù)的結(jié)果較電阻抗法更準(zhǔn)確。

3 討 論

血小板是由巨核細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生的無核、具有酶及生理活性的細(xì)胞，在生理性止血和某些病理過程中發(fā)揮著重要的作用，是研究止血和凝血障礙的重要指標(biāo)之一。血小板從骨髓釋放到外周血，半衰期5～7 d。血小板平均體積(MPV)，血小板分布寬度(PDW)越大，凝血功能越強(qiáng)。血小板曲線的平滑度可看出標(biāo)本是否凝結(jié)，曲線終點(diǎn)位置可判斷骨髓造血功能。

WHO推薦的血小板計(jì)數(shù)方法是草酸銨手工計(jì)數(shù)法，但該法存在較多不準(zhǔn)確之處[2]，如不可避免的人為誤差；血小板在計(jì)數(shù)板上的天然散布誤差；計(jì)數(shù)血小板數(shù)量少；重復(fù)性差等。如今我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的血小板計(jì)數(shù)參考方法是采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定經(jīng)單克隆抗體(CD41/61)標(biāo)記的全血血小板和紅細(xì)胞比值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)量得出的紅細(xì)胞數(shù)來計(jì)算血小板值[3]。但該法操作繁瑣、價(jià)格昂貴，無法在臨床上廣泛應(yīng)用。

本試驗(yàn)標(biāo)本均采自靜脈血，雖然靜脈采血優(yōu)于手工采血，但是采集靜脈血時(shí)需小心。首先，一定不能在輸液端采血，否則會(huì)引起血液稀釋從而導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)值偏低，試驗(yàn)中作者遇到血樣有明顯稀釋感時(shí)，會(huì)馬上和臨床取得聯(lián)系，詢問標(biāo)本采集是否得當(dāng)；其次，采血過程一定要順暢，采血不暢會(huì)引起血小板及血管壁的活化，從而影響血小板計(jì)數(shù)[4-5]。

小紅細(xì)胞及巨大血小板會(huì)影響血小板計(jì)數(shù)[6-7]，使用鞘流電阻抗法時(shí)血小板和紅細(xì)胞在同一通道內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，血小板體積多集中分布在2～30 fL之間，而紅細(xì)胞體積則集中在50～200 fL，健康人血小板體積和紅細(xì)胞體積之間有一個(gè)明顯的界限。但小紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片等會(huì)被誤認(rèn)為血小板而使其計(jì)數(shù)假性增高。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2例由于小紅細(xì)胞、紅細(xì)胞碎片較多造成血小板異常增高。MCV越小，小紅細(xì)胞數(shù)量越多，影響越大。但即使MCV值不減小，也有影響血小板計(jì)數(shù)的可能。因?yàn)榧t細(xì)胞數(shù)量是血小板的100～100倍，少量的小紅細(xì)胞或者裂片紅細(xì)胞不影響紅細(xì)胞的平均體積計(jì)算，但卻會(huì)影響血小板計(jì)數(shù)[8-9]。對(duì)血小板進(jìn)行體積大小甄別的電阻抗法不能有效識(shí)別大血小板和巨大血小板從而導(dǎo)致其計(jì)數(shù)降低[10-11]。

抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)也會(huì)影響血小板計(jì)數(shù)，也就是常說的EDTA依賴性血小板假性減少癥[12-13]。此外，血液和抗凝劑的比例也會(huì)影響檢查質(zhì)量，試驗(yàn)中作者有遇到血小板測(cè)定值偏低，檢查血樣發(fā)現(xiàn)有微小凝塊的情況。這有可能就是抗凝劑的比例不當(dāng)或者是采血不當(dāng)引起的。

冷球蛋白血癥患者血漿中存在冷球蛋白，血液涂片可見大量粗大血漿球蛋白顆粒，紅細(xì)胞均呈細(xì)錢狀或團(tuán)塊狀聚集。這些小顆粒被誤認(rèn)為是血小板從而使計(jì)數(shù)增高。在實(shí)際工作中，標(biāo)本放置的時(shí)間、試劑質(zhì)量、儀器的穩(wěn)定性、環(huán)境因素等都會(huì)影響血小板的正常計(jì)數(shù)。試驗(yàn)中作者遇到3次儀器前后兩次測(cè)定結(jié)果相差較大的情況，隨后測(cè)定第3次，去掉離群值后，將結(jié)果和其他兩種方法比較。該現(xiàn)象很可能由于標(biāo)本未搖勻或者環(huán)境因素引起的[4-5]。

由于鞘流電阻抗法計(jì)數(shù)血小板存在諸多的影響因素[14]，在實(shí)際工作中當(dāng)發(fā)現(xiàn)血小板值明顯高于或低于正常，或者當(dāng)前結(jié)果明顯不同于歷史結(jié)果時(shí)一定要注意分析，首先觀察血樣外觀，其次閱讀直方圖有無異常，然后分析是臨床用藥引起血小板數(shù)量的變化還是檢測(cè)的某個(gè)環(huán)節(jié)出了問題。利用提高采血質(zhì)量、預(yù)溫等措施來保證測(cè)量結(jié)果的可靠性。試驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)熒光染色法和人工鏡檢法的重復(fù)性不如鞘流電阻抗法好，但通過平行測(cè)定、單人操作等措施減小誤差，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示熒光染色法和人工計(jì)數(shù)對(duì)于低值血小板的辨認(rèn)準(zhǔn)確性優(yōu)于鞘流電阻抗法。因此，作者建議當(dāng)血小板小于50×109/L，直方圖異常時(shí)應(yīng)采用熒光染色計(jì)數(shù)或手工鏡檢法復(fù)檢。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.025

重慶市衛(wèi)生局項(xiàng)目資助(2012-2-60)

：李月(1980-)，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)方面的研究。△

，E-mail:liyuesun2004@163.com。

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1671-8348(2015)26-3677-03

2015-04-08

2015-06-23)