楊 霞，黃吉燕，王 明，向?qū)W熔，李潔儀，曾興琪，李叢華△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室 400015；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院口腔科 200021)

論著·臨床研究

赤芍總苷誘導(dǎo)扁平苔蘚中T細(xì)胞免疫和凋亡機制的研究*

楊 霞1，黃吉燕2，王 明1，向?qū)W熔1，李潔儀1，曾興琪1，李叢華1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室 400015；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院口腔科 200021)

目的觀察扁平苔蘚(OLP)患者赤芍總苷(TPG)治療前后T細(xì)胞免疫表達(dá)水平的變化,探討影響細(xì)胞凋亡的機制。方法應(yīng)用TPG局部治療20例OLP患者，觀察其治療后的臨床效果；且在治療前后，較系統(tǒng)地對TPG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行比較；探討OLP中的細(xì)胞凋亡情況及CD4+、CD8+T細(xì)胞和CD4+/CD8+比例的變化，分析TPG誘導(dǎo)OLP患者中的T細(xì)胞免疫與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果TPG治療扁平苔蘚臨床療效明顯，治療后患者OLP病變組織處網(wǎng)紋面積減小，糜爛面大小減少，患者疼痛指數(shù)明顯降低。治療后CD4+和CD8+表達(dá)較治療前顯著下降。結(jié)論TPG的治療可能是通過固有層中誘導(dǎo)炎性T細(xì)胞的凋亡，T細(xì)胞免疫受到調(diào)節(jié),從而減輕OLP炎癥的發(fā)生和發(fā)展，起到治療OLP的作用。

赤芍總苷；扁平苔蘚；細(xì)胞免疫；細(xì)胞凋亡

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種病因不明確的炎癥性口腔黏膜常見疾病，不具有傳染性。主要病理特征是上皮角化過度、基底層細(xì)胞液化變性與上皮下淋巴細(xì)胞浸潤、固有層炎性細(xì)胞浸潤，同時兼具有上皮細(xì)胞凋亡的增加和固有層炎性細(xì)胞凋亡的減少[1-2]。赤芍總苷(total paeony glycoside，TPG)是提取于川芍藥或毛茛科植物芍藥的干燥根的一種糖苷類物質(zhì)，具有抗凝、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗心肌或腦組織損傷等藥理作用[3]。本研究擬采用TPG溶液局部治療OLP，觀察臨床療效，并對OLP患者治療前后的黏膜中CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行檢測，用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL法)標(biāo)記凋亡細(xì)胞，以進(jìn)一步了解OLP的發(fā)病機制與細(xì)胞凋亡的機制，探討TPG治療OLP的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本實驗標(biāo)本來源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院大學(xué)城門診和牙周黏膜科門診就診的患者中，確診為OLP(診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[1])，隨機抽取男女患者各10例，年齡34～76歲。其中非糜爛型10例，糜爛型10例。苔蘚范圍：頰側(cè)黏膜的病損，其中伴唇黏膜損傷5例，伴舌部黏膜損傷7例，伴牙齦黏膜損傷6例。另取10例健康成人的口腔黏膜作為對照組；在性別和年齡構(gòu)成上進(jìn)行的統(tǒng)計分析表明：健康對照組與患者組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；研究對象均預(yù)先經(jīng)過醫(yī)患溝通，患者本人或委托家屬簽署知情同意書。OLP患者組采用TPG溶液局部涂擦，每日飯后，張口3 min以減少唾液沖洗，增加局部作用，觀察隨訪3個月，期間拒絕服用其他藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除不能遵從醫(yī)囑用藥、影響療效判斷者；排除實驗室檢查肝、腎功能異常者；排除免疫功能低下者；排除妊娠、哺乳期婦女；排除兼患有盤狀紅斑狼瘡或白斑者，或有嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病無法耐受長期全身用藥者；排除近1個月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑者。

1.2 儀器與試劑 赤芍片(生產(chǎn)批號：140201)，芍藥苷中藥化學(xué)對照品(純度：HPLC≥98%，20 mg,CAS號：23180-57-6)，D101-大孔吸附樹脂(批號：2013103101)，半自動免疫組化染色儀(BP33090210)，計算機病理圖像分析系統(tǒng)，免疫組化軟件(Cell2000版)，HE染色試劑，CD4+，CD8+鼠抗人單克隆抗體，TUNEL法原位凋亡檢測試劑盒，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5210)。

1.3 藥物的提取

1.3.1 TPG的提純制備 600 g赤芍片打成粉末，加60%乙醇6 000 mL，混合裝入燒瓶，置于電爐上提取2 h后取出醇提物；然后按上述步驟再提取1.5、1 h；所得醇提物，每次取6 000 mL,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，回收乙醇，回收體積3 600 mL；取出濃縮液，使用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8。將D101-大孔吸附樹脂用100%乙醇浸泡24 h，取出浸泡出來的油脂，裝柱，超純水清洗至無醇味；將濃縮液上樣，1 kg藥材對應(yīng)3 L樹脂。洗脫，水洗2～3倍柱樹脂體積，70%乙醇洗，3～4倍柱體積收集，洗脫速度為每小時2倍柱體積；收集乙醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇；所得赤芍苷藥溶液濃縮干燥，加入雙蒸水500 mL，過濾除菌，得到無菌赤芍藥液，置無菌試管中，冰箱保存。

1.3.2 TPG的含量測定 取0.001 5 g芍藥苷用甲醇定容至10 mL的容量瓶，得0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品液；分別精密吸取芍藥苷對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL至巨塞試管中，水浴揮干溶劑，以空白試劑為對照，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL,高氯酸0.8 mL,密塞搖勻，60 ℃水浴加熱20 min取出，冰水浴冷卻，加冰醋酸5 mL搖勻，560 nm處測定吸光度值。取供試品0.15 mL按上述方法測定吸光度值。

1.3.3 藥物療效的判定標(biāo)準(zhǔn)[2]痊愈即患者疼痛癥狀消失，黏膜色澤正常，皮損完全消退；顯效即無明顯自覺癥狀，糜爛的黏膜愈合，充血范圍或Wickham紋縮小2/3以上，或皮損消退70%以上；有效即自覺癥狀減輕，黏膜局部有充血，Wickham紋減少，糜爛面積減少小于2/3，或皮損消退30%～70%；無效即病情變化不明顯或皮損消退不足30%。以痊愈和顯效者相加來計算有效率。

1.4 檢測方法 對未接受過治療的健康對照組、OLP患者治療前后取標(biāo)本檢測，觀察染色結(jié)果。(1)石蠟切片 HE 染色。(2)應(yīng)用免疫組化SP法檢測20例OLP組織中赤芍總苷治療前后的CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平。淋巴細(xì)胞計數(shù)即對固有層CD4+、CD8+T免疫組化染色后細(xì)胞胞質(zhì)呈黃褐色的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。病變典型區(qū)的固有層各隨意計數(shù)6個(40×10)的高倍視野，取平均值。(3)TUNEL法定位檢查：上皮細(xì)胞層是計算單位上皮細(xì)胞層長度里查見的凋亡細(xì)胞數(shù)目，而固有層是計算凋亡細(xì)胞的百分比。本研究檢測20例OLP患者TPG治療前后的細(xì)胞凋亡情況，并檢查上皮細(xì)胞和固有層炎性細(xì)胞的凋亡變化情況。

2 結(jié) 果

2.1 TPG的含量測定 以TPG吸光度值為橫坐標(biāo)，TPG含量為縱坐標(biāo)，繪制TPG含量線性圖鑒定得出芍藥苷含量為5.51%，TPG純度大于90%，符合實驗要求；在臨床使用前，總提取物采用適量生理鹽水(NS)稀釋成各所需濃度。

2.2 療效判斷結(jié)果 患者局部治療期間未出現(xiàn)不適或藥物不良反應(yīng)，血常規(guī)、尿常規(guī)、肝、腎功能等各項指標(biāo)未見異常。臨床療效表明，經(jīng)局部治療后，痊愈9例(45%)，顯效4例(20%)，有效3例(15%)，無效4例(20%，其中2例因療效不明顯，拒絕活檢)，有效率達(dá)65%。治療組療效明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。治療后檢查可見扁平苔蘚病變組織處網(wǎng)紋面積減小，紅腫糜爛面范圍變小，患者疼痛指數(shù)降低。OLP患者應(yīng)用TPG溶液局部治療后與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后治療組各指標(biāo)改善程度明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。

2.3 CD4+、CD8+細(xì)胞染色結(jié)果及 CD4/CD8+比例變化 免疫組化分析比較正常組織及OLP組織中CD4+,CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況：結(jié)果表明 CD4+和CD8+表達(dá)在OLP固有層組織中明顯升高，T 細(xì)胞數(shù)與正常對照組織相比顯著增加(P<0.05)，驗證了T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在OLP的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用(表1)。而OLP患者使用TPG后，固有層 CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯減少，其中 CD8+T細(xì)胞主要表達(dá)于接近基底膜破壞處的固有層淺層，CD4+T細(xì)胞主要表達(dá)于固有層深層。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：治療后CD4+、CD8+均有表達(dá)降低，向正常值靠近趨勢，TPG的治療調(diào)節(jié)了T細(xì)胞的相關(guān)免疫(圖1)。

表1 對照組、OLP 患者治療前后 CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)及

2.4 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 TUNNEL法定位檢測治療前后OLP組織上皮細(xì)胞層及固有層細(xì)胞凋亡變化情況：在口腔扁平苔蘚上皮及固有層均可見凋亡細(xì)胞。正常組織的上皮細(xì)胞層凋亡細(xì)胞數(shù)為0.1～0.4/0.25 mm，平均為0.2；固有層細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例為0.21%～1.4%，平均0.93%。而治療后OLP患者的上皮細(xì)胞層凋亡細(xì)胞數(shù)為0.0～8.3/0.25 mm，平均為1.4；固有層細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例為0.03%～10.51%，平均1.11%。OLP的上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)，凋亡細(xì)胞多位于基底層或基底上層，且多發(fā)生于基底細(xì)胞液化變性處上皮;OLP固有層的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。隨著上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，在固有層細(xì)胞的凋亡比例也顯著升高(表2,圖2)。

表2 OLP 患者使用藥物前后與對照組細(xì)胞凋亡情況

綜合以上結(jié)果，得出結(jié)論：TPG的治療可能是通過固有層中誘導(dǎo)炎性T細(xì)胞的凋亡，T細(xì)胞免疫受到調(diào)節(jié),減輕了OLP炎癥的發(fā)生和發(fā)展，最終起到治療OLP的作用。

A、D：正常黏膜；B、E：OLP患者黏膜；C、F：TPG治療后黏膜。

圖1 免疫組化染色

A：正常上皮細(xì)胞；B：OLP患者上皮細(xì)胞；C：OLP患者TPG治療后的上皮細(xì)胞。

圖2 細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討 論

OLP是比較頑固的口腔黏膜疾病，病程長，病因和確切的發(fā)病機制仍然不明確[1-2]。OLP 的發(fā)病可能以細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)為主，皮損內(nèi)主要是親表皮性的T細(xì)胞浸潤。發(fā)病過程中，先激活CD4+T細(xì)胞，分泌干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)等多種細(xì)胞因子，啟動局部細(xì)胞的免疫反應(yīng)體系。后期占主導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞與基底層角質(zhì)形成細(xì)胞損傷有關(guān)，進(jìn)一步發(fā)展成OLP皮損。所以學(xué)者們傾向認(rèn)為OLP是一種CD4+T淋巴細(xì)胞與其分泌的細(xì)胞因子起關(guān)鍵作用的自身免疫性疾病，也是和細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞免疫功能紊亂的自身免疫性疾病，以皮下結(jié)締組織內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤為特征的慢性非感染性炎癥[4-5]。

Khan等[6]發(fā)現(xiàn)上皮內(nèi)、上皮下淺表固有層大多數(shù)淋巴細(xì)胞為CD8+細(xì)胞，且CD8+細(xì)胞與凋亡的角質(zhì)細(xì)胞相鄰。本實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)OLP上皮內(nèi)凋亡的細(xì)胞相鄰有浸潤的T細(xì)胞，對固有層內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與OLP中固有層中淋巴細(xì)胞的凋亡指數(shù)之間呈現(xiàn)出相應(yīng)的負(fù)性關(guān)系，對照組CD4/CD8比值比明顯降低(P<0.05)，提示OLP中存在T細(xì)胞亞群平衡失調(diào)和T淋巴細(xì)胞功能紊亂。實驗結(jié)果與國內(nèi)研究結(jié)果一致[6-8]，所以作者認(rèn)為：(1) 在TPG藥物誘導(dǎo)下，OLP中上皮細(xì)胞的抗原性可能發(fā)生部分改變，聚集了趨化的T淋巴細(xì)胞；(2) 增加的CD8+T細(xì)胞可能引起上皮基底細(xì)胞發(fā)生凋亡；(3) T淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)目的減少與OLP的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、慢性遷延可能有一定的內(nèi)在聯(lián)系；(4)在CD8+T細(xì)胞的攻擊和誘導(dǎo)作用下，OLP的基底細(xì)胞產(chǎn)生液化變性和上皮細(xì)胞凋亡的增加。因此T細(xì)胞的浸潤和細(xì)胞凋亡異?？赡芘c基底細(xì)胞液化變性有關(guān)系，但是在細(xì)胞凋亡和液化變性之間，哪個是初發(fā)損害和繼發(fā)損害還有待進(jìn)一步研究。

目前在OLP的治療中，西醫(yī)局部用藥多采用藥膜敷用、糊劑涂用等，全身用藥多采用免疫調(diào)節(jié)劑，甚至采取口服潑尼松激素治療或氯喹治療，不僅藥物的不良反應(yīng)較大，毒副作用明顯，且療效不確定，有較高的復(fù)發(fā)率。由于治療方法的局限性，尋求一種安全有效、能控制扁平苔蘚的治療方法和治療藥物是國內(nèi)學(xué)者們一致在追求和探索的課題[9-10]。TPG具有調(diào)節(jié)免疫和調(diào)控基因等作用，從而影響細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞分化等。

本實驗對TPG治療前后OLP組織，應(yīng)用免疫組化法分析CD4+,CD8+的表達(dá)情況，表明治療后CD4+、CD8+均有表達(dá)降低，且趨向正常值；TPG的治療誘導(dǎo)調(diào)節(jié)了T細(xì)胞的相關(guān)免疫功能。TUNNEL法對凋亡細(xì)胞定位檢測標(biāo)記結(jié)果，也說明了TPG能調(diào)節(jié)OLP發(fā)病中的細(xì)胞免疫功能和細(xì)胞凋亡，對OLP炎癥發(fā)生、發(fā)展起到減輕作用，從而達(dá)到OLP的治療目的；也進(jìn)一步為TPG的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)的實驗數(shù)據(jù)和合理的理論依據(jù)。

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Effect on the level of T cells immunity and mechanism of apoptosis in the Oral lichen planus patients induced by the total paeony glycoside*

YangXia1,HuangJiyan2，WangMing1，XiangXuerong1,LiJieyi1，ZengXingqi1，LiConghua1△

(1.Stomatologyhospital,ChongqingMedicalUniversity，ChongqingkeyLaboratoryforOralDiseasesandBiomedicalSciences；2.Stomatologydepartment，Shuguanghospital，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine)

ObjectiveObserve the effect of Total paeony glycoside(TPG)has on the T-cell immune action and apoptosis process of Oral lichen planus patients and analyze the mechanism.Methods20 OLP patients are recruited into this experiment,each is treated with TPG,and their clinical effect is taken notes of.Observe the apoptosis of OLP lesions from each of the patients before and after the treatment,compare the apoptosis condition and the expression of CD4+,CD8+,and the CD4+/CD8+ratio,to analyze the role TPG plays on the immune expression of T-cell and the effect on apoptosis process.ResultsTPG improve the clinical manifestation of OLP patients significantly,resulting in the decrease of reticulum and erosive areas,and the pain index is decreased obviously.The expression of CD4+and CD8+are decreased in OLP lesions after the treatment of TPG.ConclusionTPG may induce the apoptosis of the T-cell in lamina propria of the OLP lesions to regulate the T-cell immune action of OLP patients,and slow the development of inflammatory process of OLP,and in that way,TPG shows its potential in treating OLP,and this experiment can provide the primary evidence.

total paeony glycoside；oral lichen planus;cells immunity；cells apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.007

重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研計劃項目(2010-2-67)；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項目(2012-1-056)。

：楊霞(1976-)，博士，副主任醫(yī)師,主要從事口腔疾病的防治工作?！?/p>

，E-mail:liconghua1@163.com。

R780.2

A

1671-8348(2015)26-3622-03

2015-04-08

2015-06-28)