靳丹丹，毛 華

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州 510000)

論著·基礎(chǔ)研究

S-腺苷蛋氨酸對奈乙硫氰酸酯致大鼠藥物型膽汁淤積性肝病肝纖維化的保護(hù)作用

靳丹丹，毛 華△

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州 510000)

目的研究S-腺苷蛋氨酸(SAMe)對奈乙硫氰酸酯(ANIT)誘發(fā)大鼠藥物型膽汁淤積性肝病肝纖維化的保護(hù)作用。方法將18只SD大鼠分為3組：A組(空白對照組)、B組(造模+NS)、C組(造模+SAMe)，每組各6只，各組大鼠腹腔注射后72 h處理。采用全自動生化分析儀檢測各組肝臟血清學(xué)指標(biāo)，并取肝臟組織行HE染色及MASSON染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化及膠原含量改變。結(jié)果C組大鼠的血清學(xué)指標(biāo)谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBiL)、直接膽紅素(DBiL)、間接膽紅素(IBiL)、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)明顯低于B組，3組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但3組之間總膽固醇(Chol)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。C組大鼠的膠原纖維含量及膠原纖維面積比均明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論SAMe能通過改善藥物型膽汁淤積性肝病的肝功能，降低膠原纖維含量及面積，進(jìn)一步保護(hù)肝臟組織。

肝硬化；膽汁淤積，肝內(nèi)；S-腺苷蛋氨酸

藥物型膽汁淤積性肝病(drug induced cholestatic hepatis)是藥物及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的毒性作用或發(fā)生的過敏反應(yīng)導(dǎo)致的膽汁形成、分泌和(或)排泄異常引起的肝臟病變。S-腺苷蛋氨酸(S-adensyl-L-methionyne，SAMe)又稱S-腺苷甲硫氨酸，是含硫氨基酸的一種，是存在于人體組織的一種生理活性分子，由蛋氨酸與三磷酸腺苷在腺苷蛋氨酸合成酶催化下合成的，目前已廣泛應(yīng)用于治療膽汁淤積性肝病，但其作用機制還未完全闡述清楚。本實驗采用經(jīng)口灌服奈乙硫氰酸酯(alpha-naphthyliso thiocyanate，ANIT)致藥物性膽汁淤積，從而進(jìn)一步研究SAMe對ANIT誘發(fā)膽汁淤積大鼠肝細(xì)胞、肝功能的影響，探討SAMe對藥物型膽汁淤積性肝病的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康剛斷乳的雄性清潔級SD大鼠18只，體質(zhì)量(100±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗材料 注射用腺苷蛋氨酸(思美泰，500 mg/支)，ANIT(美國Sigma公司)，臺式冷凍離心機，恒溫水浴箱，自動生化分析儀，光學(xué)顯微鏡。

1.3 動物模型的建立及處理 將18只SD大鼠分為3組，每組各6只，每組動物分籠飼養(yǎng)，普食，自來水適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，在第3 d上午造模組和實驗組每只大鼠按50 mg/kg灌服1% ANIT+麻油混合液1次(ANIT 50 mg/kg，麻油 5 mL/kg)，空白組給予相同劑量的生理鹽水。灌胃前后12 h所有動物均禁食不禁水，以保證所灌服藥物充分均勻的吸收。灌胃12 h后，實驗組(C組)給予SAMe腹腔注射，注射量為60 mg/kg，空白對照組(A組)和造模組(B組)給予0.9% 氯化鈉注射液腹腔注射，注射量同實驗組的SAMe溶液量。各組大鼠腹腔注射后72 h處理[1]，6%水合氯醛250 mg/kg腹腔注射麻醉后，逐層剪開腹腔，分離腹主動脈，抽取2 mL動脈血置于促凝管內(nèi)，4 000 r/min離心10 min，吸出血清，-20 ℃冰箱保存待檢。抽血后取部分肝臟組織，生理鹽水沖洗后立即放入液氮中保存待檢。

1.4 觀察指標(biāo) 收集血清學(xué)標(biāo)本及肝臟組織，采用全自動生化分析儀檢測各組肝臟組織血清學(xué)指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBiL)、直接膽紅素(DBiL)、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GGT)、堿性磷酸酶(ALP)的變化；肝臟組織進(jìn)行HE染色及Masson染色，評估肝纖維化程度及膠原纖維面積及定量，每例切片隨機選取5個不重復(fù)的視野(×400倍)，Masson染色以藍(lán)色膠原沉積為陽性信號，用Image-Pro Plus6.0軟件分析圖片，使用Invert contrast反相應(yīng)用照片,使用Photoshop轉(zhuǎn)化為黑白灰階，校正吸光度，以消除照片亮度及對比度不一致的誤差。測量積分吸光度(IOD),計算平均吸光度(average optical density,AOD)，AOD=IOD/(總面積-空白面積)，空白面積指照片中非藍(lán)色組織的空白區(qū)域面積，以AOD來反映膠原纖維表達(dá)水平；膠原纖維沉積面積計算：使用上述選取視野圖片，同樣用Image-Pro Plus6.0軟件分析圖片，測量積分面積(area)，計算膠原纖維面積百分比，膠原纖維面積百分比=膠原纖維面積/肝組織面積×100%。

2 結(jié) 果

2.1 3組之間血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的比較 通過表1可以發(fā)現(xiàn)，C組的血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST、AKP、TBiL、DBiL、IBiL、GGT、TBA均明顯下降，與A組及B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但3組之間總膽固醇(Chol)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與C組比較，B組ALT、AST、AKP、TBiL、DBiL、TBA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而IBiL、GGT、Chol差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而A組僅AST、TBiL、DBiL、IBiL、TBA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ALT、AKP、GGT、Chol差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與A組比較，B組ALT、AST、AKP、TBiL、DBiL、GGT、TBA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但I(xiàn)BiL差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肝臟病理組織學(xué)變化 HE染色，光鏡下觀察，B組肝內(nèi)廣泛纖維組織增生，假小葉形成，膽管增生，炎性細(xì)胞浸潤明顯，肝細(xì)胞明顯腫脹，有些呈空泡狀變性，碎屑狀壞死；而C組顯示肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，未見明顯纖維化，膽小管擴張等現(xiàn)象；A組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤及纖維增生(圖1)。

2.3 3組肝臟組織膠原纖維定量比較 正常肝臟組織可見少量膠原纖維沉積，在MASSON染色中，膠原纖維呈藍(lán)色分布。B組膠原纖維陽性表達(dá)量明顯增多，主要聚集在門靜脈、匯管區(qū)、纖維間隔和鄰近的肝竇，在炎性細(xì)胞浸潤區(qū)的表達(dá)也明顯增加；C組匯管區(qū)、纖維間隔和鄰近的肝竇膠原纖維表達(dá)量(175.1±127.9)及膠原纖維沉積面積比(14．1±6.4)顯著減少，與B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Parea%=0.001,PAOD=0.000)；與A組比較，P<0.05(Parea%=0.067,PAOD=0.029)；A組與B組之間膠原纖維面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)；統(tǒng)計分析，總體方差齊性Farea%=35.746，F(xiàn)AOD=92.278。

表1 3組治療72 h時肝臟血清學(xué)指標(biāo)變化情況比較

A：A組HE染色；B：B組HE染色；C:C組HE染色。

圖1 SMAe對ANIT致大鼠急性膽汁淤積性肝病肝組織形態(tài)學(xué)的影響(×100)

A：A組Masson染色；B:B組Masson染色；C:C組Masson染色。

圖2 SMAe對ANIT致大鼠急性膽汁淤積性肝病肝組織形態(tài)學(xué)的影響(×400)

表2 3組治療72 h時肝臟膠原纖維量及膠原纖維面積的比較(×400)

表3 3組治療72 h時肝臟膠原纖維面積百分比的比較(×400)

3 討 論

肝臟是人體重要的代謝及解毒器官，藥物經(jīng)呼吸道、消化道及靜脈進(jìn)入人體后，經(jīng)過肝臟的解毒功能，轉(zhuǎn)化成相對安全的代謝產(chǎn)物，從而排出體外，所以，肝臟與藥物具有密切的關(guān)系。藥物型膽汁淤積性肝病是由于藥物本身及其代謝產(chǎn)物的作用導(dǎo)致肝功能的損害，屬于藥物型肝損害中最常見的一種，目前還未發(fā)現(xiàn)有效的預(yù)測指標(biāo)及診療手段[2]。它作為臨床上一種常見病，因其病程較長，損傷較重，常遷延發(fā)展，成為臨床上一大難題，其中，約50%的患者導(dǎo)致肝衰竭[3]。近年來，隨著新藥的研發(fā)、藥物的廣泛應(yīng)用以及多種藥物的聯(lián)合應(yīng)用，引起藥物性肝損害的比例呈現(xiàn)逐年增長的趨勢。據(jù)調(diào)查，大約有1 100余種藥物可引起肝損害。另外，朱超慧等[4]研究表明，引起藥物性肝損害的藥物主要為抗生素類，其中抗結(jié)核藥58例，占87．88%，且女性多于男性；此外國內(nèi)外也有關(guān)于抗腫瘤藥物、抗結(jié)核藥物、中藥及免疫抑制劑引起肝損害的報道[5-8]。根據(jù)2005年美國食品與藥品監(jiān)督管理局(Food and Drugs Administration，F(xiàn)DA)藥物肝毒性委員會及結(jié)合國際藥物性肝損害標(biāo)準(zhǔn)，將藥物性肝損害分為：肝細(xì)胞損害型、膽汁淤積型、混合型。

目前，藥物型膽汁淤積性肝病是引起急性肝衰竭及肝移植的重要原因之一，對于其致病機制的探索仍是臨床上一項重大挑戰(zhàn)。有研究表明，外源性物質(zhì)，如親脂性化合物經(jīng)過細(xì)胞色素P450系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為親水性化合物，從而產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物；大量消耗抗氧化產(chǎn)物，加重胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化，增加線粒體細(xì)胞膜的通透性，減少ATP的合成，抑制Ca2+依賴性ATP酶的活性，使Ca2+的螯合能力下降[9]。同時，年齡、既往肝臟病變病史、酶誘導(dǎo)及抑制作用、基因多樣性等都會影響這個過程。對于膽汁淤積性肝病的治療，臨床上主要有熊去氧膽酸(UDCA)、SAMe、激素及免疫抑制劑、ERCP及內(nèi)鏡下治療、肝移植及血液凈化治療等等。

SAMe是含硫氨基酸的一種，是存在于人體組織的一種生理活性分子，由蛋氨酸與三磷酸腺苷在腺苷蛋氨酸合成酶催化下生成。它作為甲基供體(轉(zhuǎn)甲基作用) 和生理性巰基化合物(如半胱氨酸、?；撬?、谷胱甘肽和輔酶 A)的前體(轉(zhuǎn)硫基作用) 參與體內(nèi)重要的生化反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于治療各種原因?qū)е赂蝺?nèi)膽汁淤積性疾病，如急慢性肝炎、肝硬化及妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積等，其退黃效果明顯，療效肯定，其臨床功效已經(jīng)得到驗證，但其發(fā)病機制尚未完全闡明[10]。目前，關(guān)于SAMe對于藥物型膽汁淤積性肝病的中有關(guān)膠原纖維含量及面積的研究較少。本研究中通過SAMe作用于奈乙硫氰酸酯(ANIT)致急性藥物型膽汁淤積性肝病的大鼠模型上，比較其各項肝功能指標(biāo)、病理學(xué)改變及膠原纖維含量及面積的變化。分析顯示，SAMe組的ALT、AST、ALP、TBiL、DBiL、IBiL、TBA明顯下降，與空白對照組及造模組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證明了SAMe對藥物型膽汁淤積性肝病具有顯著的保護(hù)作用，與文獻(xiàn)一致。病理切片中可見SAMe組肝內(nèi)無明顯纖維組織增生及假小葉形成，炎性細(xì)胞浸潤不明顯，膽管增生、肝細(xì)胞腫脹、空泡狀變性，碎屑狀壞死均較生理鹽水造模組明顯減輕。Masson染色中可見SAMe組膠原纖維定量及面積均明顯低于造模組，與空白對照組接近，說明SAMe可以通過降低膠原纖維的含量及面積，延緩肝纖維化的進(jìn)展，進(jìn)一步保護(hù)肝臟組織的作用。這可能與其以下方面有關(guān)。SAMe可提高超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性，抑制肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄生長因子(TGF-β1)的表達(dá)，有效抑制肝星狀細(xì)胞的增殖及Ⅰ型膠原的合成，延緩肝纖維化[11]；Chtourou等[12]研究表明，SAMe還可抑制前膠原mRNA的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而阻斷肝纖維化的進(jìn)程。另外，S-腺苷蛋氨酸還可通過轉(zhuǎn)甲基作用增加膜磷脂的生物合成，增加膜流動性并加Na+-K+ATP酶活性，加快膽酸轉(zhuǎn)運；同時通過轉(zhuǎn)巰基作用，增加生成細(xì)胞內(nèi)主要解毒劑谷胱甘肽和半胱氨酸，增加肝細(xì)胞的解毒作用和對自由基的保護(hù)作用，生成的?；撬峥膳c膽酸結(jié)合，增加其可溶性。Jeon等[13]研究表明，S-腺苷蛋氨酸通過抑制次黃嘌呤核酸轉(zhuǎn)化成次黃嘌呤，從而提高肝臟組織腺苷濃度，有助于肝細(xì)胞ATP的生成。張釗等[14]研究表明，SAMe還可以通過降低肝臟各種細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)，增強和肝X受體α(LXRα)的表達(dá),最終導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平降低和白細(xì)胞介素-10(IL-10)水平增高，進(jìn)一步減輕內(nèi)毒素所致的肝損害[14]。

總之，S-腺苷蛋氨酸有助于改善藥物型膽汁淤積性肝病的肝功能，降低肝臟組織的膠原纖維，延緩肝纖維化的進(jìn)展，對其作用機制的深入探究為將來臨床提供可靠的依據(jù)及基礎(chǔ)。

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統(tǒng)計資料類型

統(tǒng)計資料共有三種類型：計量資料、計數(shù)資料和等級資料。按變量值性質(zhì)可將統(tǒng)計資料分為定量資料和定性資料。

定量資料又稱計量資料，指通過度量衡的方法，測量每一個觀察單位的某項研究指標(biāo)的量的大小，得到的一系列數(shù)據(jù)資料，其特點為具有度量衡單位、多為連續(xù)性資料、可通過測量得到，如身高、紅細(xì)胞計數(shù)、某一物質(zhì)在人體內(nèi)的濃度等有一定單位的資料。

定性資料分為計數(shù)資料和等級資料。計數(shù)資料為將全體觀測單位(受試對象)按某種性質(zhì)或特征分組，然后分別清點各組觀察單位(受試對象)的個數(shù)，其特點是沒有度量衡單位，多為間斷性資料，如某研究根據(jù)患者性別將受試對象分為男性組和女性組，男性組有72例，女性組有70例，即為計數(shù)資料。等級資料是介于計量資料和計數(shù)資料之間的一種資料，可通過半定量的方法測量，其特點是每一個觀察單位(受試對象)沒有確切值，各組之間僅有性質(zhì)上的差別或程度上的不同，如根據(jù)某種藥物的治療效果，將患者分為治愈、好轉(zhuǎn)、無效或死亡。

Protective effects of S-adenosyl methionyne on liver fibrosis of rats with cholestatic liver disease induced by alpha-naphthyliso thiocyanate

JinDandan,MaoHua△

(DepartmentofDigestiveSystem,ZhujiangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510000,China)

ObjectiveTo study the protective effects of S-adenosyl methionine(SAMe) on liver fibrosis of rats with cholestasis induced by alpha-naphthyliso thiocyanate.Methods18 SD rats were randomly divided into three groups,the group A (blank control group),B [model+ normal saline(NS)] and C (model + SAMe),6 rats in each group.The rats in each group were sacrificed at 72 h after intraperitoneal injection.Serum levels of liver indicators in each group were detected by the full automatic biochemical analyzer.The liver tissue was taken for conducting HE staining and MASSON staining and observing the pathological changes of livers.ResultsCompared with the group B,the serum levels of ALT,AST,TBiL,DBiL,IBiL,R-GGT,ALP and TBA in the group C were significantly decreased,the differences among 3 groups were statistically significant(P<0.05);but the total Chol level had no statistical difference among 3 groups(P>0.05).The collagen fibers content (175.1±127.9) and the collagen fibers area ratio(14.1±6.4) in the group C were significantly lower than those in the group B,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionSAMe can decrease the content and area of collagen fibers and further protect the liver tissue by improving the liver function in drug induced cholestasis liver disease.

liver cirrhosis;cholestasis,intrahepatic;S-adenosyl methionine

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.003

靳丹丹(1989-)，碩士，主要從事藥物型膽汁淤積性肝病方面的研究?！?/p>

，E-mail:Huam@fimmu.com。

R575

A

1671-8348(2015)26-3609-04

2015-03-08

2015-07-16)