竺利紅，焦巧芳，尹小良，張 紅，施躍峰*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a植物保護(hù)與微生物研究所，b浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江杭州 310021；2.趙縣農(nóng)牧局，河北石家莊 051530；3.紹興市越城區(qū)東湖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，浙江紹興 312001；4.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州 310013）

發(fā)酵法制備黃芪藥渣飼料添加劑活性物質(zhì)

竺利紅1ab，焦巧芳2，尹小良3，張 紅4，施躍峰1ab*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a植物保護(hù)與微生物研究所，b浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江杭州 310021；2.趙縣農(nóng)牧局，河北石家莊 051530；3.紹興市越城區(qū)東湖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，浙江紹興 312001；4.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州 310013）

以黃芪藥渣為發(fā)酵底物，以棘孢木霉為發(fā)酵菌種，制備中藥渣飼料添加劑，檢測產(chǎn)物中各類活性物質(zhì)。結(jié)果表明，黃芪藥渣經(jīng)棘孢木霉發(fā)酵后，能產(chǎn)生以β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶為主的豐富酶系；與發(fā)酵前相比，黃芪甲苷在發(fā)酵液中的釋放量增加了4倍；發(fā)酵產(chǎn)物對變形桿菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等細(xì)菌有較強的抑制作用。表明利用棘孢木霉發(fā)酵黃芪藥渣制備飼料添加劑具有較好的開發(fā)潛力。

黃芪；棘孢木霉；發(fā)酵；黃芪甲苷

黃芪為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的根，是中醫(yī)臨床最常用的大宗藥材之一。黃芪的主要活性物質(zhì)為黃芪皂苷、黃酮、多糖、單糖等，具有補氣升陽、益氣固表、托毒生津和利水消腫功效，在獸醫(yī)臨床上可用于防治雞傳染性法氏囊病，提高蛋雞產(chǎn)蛋率和飼料報酬、降低淘汰死亡率，提高肥育豬的生長和屠宰性能，改善肉的品質(zhì)［1-2］。

目前黃芪及復(fù)方制劑的提取方法主要是醇提法和水提法，產(chǎn)生的黃芪藥渣仍含有豐富的活性物質(zhì)，可作為飼料添加劑被再次利用［3］。目前中草藥渣在飼料添加劑中的運用大多采用干燥粉碎后按一定比例直接添加到飼料中的方法。藥渣中活性成分、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)元素往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，植物細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，除草食動物外，其他動物不能消化吸收纖維素、半纖維素等物質(zhì)。因此，藥渣作為飼料添加劑直接添加，對非草食動物而言，活性成分和營養(yǎng)元素并不能被很好地吸收，導(dǎo)致其在飼料中添加量大增，在浪費資源的同時也破壞了飼料的營養(yǎng)配比，甚至大多數(shù)情況下因添加量太大而無法配制；同時，藥渣中主要組成部分纖維素和半纖維素等也因為無法被非草食動物吸收而造成浪費。

微生物在代謝過程中可分泌蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等幾十種胞外酶進(jìn)入培養(yǎng)基，不僅可以水解植物細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等，將它們轉(zhuǎn)化成動物和人體可直接利用的小分子糖、單糖、多肽和氨基酸等，提高營養(yǎng)成分，還可以使植物細(xì)胞破裂，有利于有效成分和營養(yǎng)物質(zhì)溶出；同時微生物自身還能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，它們中的一些活性物質(zhì)可與中藥有效成分發(fā)生協(xié)同作用擴(kuò)大藥效。本試驗利用棘孢木霉（Trichoderma asperellum）發(fā)酵黃芪藥渣制備飼料添加劑，并對其活性物質(zhì)展開了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 2.5 g，K2HPO42.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH值7.0。

PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂18 g，水1 L，pH值自然。

藥渣培養(yǎng)基。黃芪藥渣1 g，麩皮1.4 g，淀粉1.4 g，水35 m L，pH值5.5。

對照培養(yǎng)基。麩皮1.4 g，淀粉1.4 g，水35 mL，pH值5.5。

1.2 方法

1.2.1 黃芪藥渣的制備

取黃芪150 g，加600 mL蒸餾水浸泡30 min，煮沸20 m in，倒掉浸煮液；再加600 m L蒸餾水繼續(xù)煮沸20 m in，倒掉浸煮液；105℃烘干2 h至恒重，粉碎，過60目篩。

普陀區(qū)桃浦鎮(zhèn)北環(huán)水系長度約為3500m，寬度為8～18m，水域面積為 4.1×104m2，水域深度為 0.7～2.5m。在對水質(zhì)特點進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)由于受到多年工業(yè)廢水、生活污水以及雨污混流等因素的影響，導(dǎo)致水域內(nèi)的污染物嚴(yán)重積累，河水的流動性相對較差，甚至出現(xiàn)季節(jié)性“黑臭”的問題，嚴(yán)重影響了城市美觀。雨季時，會有大量的雨水和污水流入，經(jīng)過2015年清淤處理后，雖然可以接納一定點源以及面源污染物，但仍有大量的污染物進(jìn)入河道內(nèi)，影響了河道排污口的排污效果。實地考察結(jié)果顯示，河道內(nèi)依然有少量魚群存活，河道兩側(cè)有少量挺水植物生長，整個河道內(nèi)并無任何沉水植物生長。

1.2.2 黃芪藥渣發(fā)酵液的制備

取新鮮培養(yǎng)的棘孢木霉PDA斜面，刮下孢子，用無菌生理鹽水制成濃度為1×108mL-1的孢子懸浮液。按3%的接種量接入藥渣培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)120 h。然后9 000 r·min-1離心10 m in，取上清液，備用。

1.2.3 酶活性測定

取上述上清液，檢測羧甲基纖維素鈉酶（CMC酶）、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果膠酶的活性，具體測定方法參照文獻(xiàn)［4-8］。

1.2.4 黃芪甲苷含量測定

取上清液15 m L，用10 m L水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層。用15 m L 1%NaOH溶液洗滌2次，15 m L水飽和正丁醇洗滌2次至中性。80℃水浴蒸干正丁醇層，用3 m L甲醇溶解，0.45μm濾膜注射過濾后用于HPLC測定。色譜柱采用Sunfire柱，流動相為乙腈∶水43∶57，流速為1 mL·min-1，檢測波長203 nm，進(jìn)樣量為10μL。配制黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5 mg·mL-1。測定樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，藥渣發(fā)酵液中黃芪甲苷的含量計算公式：

式中C為樣品中黃芪甲苷含量，A為樣品HPLC圖譜的峰面積；B為標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜的峰面積。

1.2.5 抑菌活性測定

采用杯碟法。將0.1 m L檢測菌液（菌數(shù)約為107m L-1）均勻涂在肉湯固體平板上，室溫干燥30 m in后，將牛津杯（內(nèi)徑為6 mm）均勻放置在平板上，吸取0.1 m L藥渣發(fā)酵上清液于杯中，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。各重復(fù)3次，取平均值。設(shè)置2個對照，CK1為牛津杯中添加沒有接菌的空白藥渣培養(yǎng)基上清液，CK2為棘孢木霉在對照培養(yǎng)基上的發(fā)酵上清液。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活性

棘孢木霉在黃芪藥渣培養(yǎng)基上培養(yǎng)48，60，72，84和96 h時，分別測定CMC酶、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果膠酶的活性，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，棘孢木霉能在含有黃芪藥渣的培養(yǎng)基上較好地生長并產(chǎn)生豐富的酶系，培養(yǎng)60 h時，CMC酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的最大酶活性均超過1 000 U·m L-1。

表1 不同培養(yǎng)時間的酶活測定結(jié)果U·m L-1

2.2 黃芪甲苷

黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜顯示，本研究中HPLC系統(tǒng)的黃芪甲苷吸收峰出現(xiàn)在第4 min（圖1）。因此，通過計算試驗樣品HPLC圖譜在第4 min的吸收峰面積，可以得出黃芪藥渣發(fā)酵液中黃芪甲苷的含量。結(jié)果表明，黃芪藥渣發(fā)酵0，60，72，84，96和120 h后，其上清液中黃芪甲苷的含量分別為（0.11±0.027）%，（0.22±0.003）%，（0.28±0.014）%，（0.41±0.036）%，（0.57± 0.027）%和（0.53±0.041）%，表明黃芪藥渣經(jīng)棘孢木霉發(fā)酵后，細(xì)胞壁被降解和破壞，胞內(nèi)的黃芪甲苷被逐步釋放出來，發(fā)酵96 h時黃芪甲苷含量達(dá)到最高。

2.3 抑菌活性

取發(fā)酵96 h的藥渣發(fā)酵液，檢測其對變形桿菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌5種常見細(xì)菌的抑菌活性，結(jié)果如表2所示。棘孢木霉和黃芪藥渣對5種細(xì)菌的抑菌圈直徑均為0 mm，表明棘孢木霉和黃芪藥渣本身沒有抑菌活性；而黃芪藥渣發(fā)酵液對5種細(xì)菌的抑菌圈直徑為19.1～29.9 mm，表明黃芪藥渣經(jīng)過棘孢木霉發(fā)酵后發(fā)酵液中產(chǎn)生了具有抑菌作用的活性物質(zhì)。

圖1 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

表2 藥渣發(fā)酵液的抑菌活性

3 小結(jié)與討論

棘孢木霉能在含有黃芪藥渣的培養(yǎng)基中較好地生長，而且能產(chǎn)生β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶、濾紙酶和CMC酶等，這些酶不僅可以降解黃芪藥渣的細(xì)胞壁，釋放出胞內(nèi)殘留的黃芪甲苷，還能將細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等轉(zhuǎn)化為動物可直接利用的小分子糖、單糖、多肽和氨基酸等，提高營養(yǎng)成分，促進(jìn)動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同時棘孢木霉自身還能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，其中的一些活性物質(zhì)可以與黃芪的有效成分發(fā)生協(xié)同作用擴(kuò)大藥效，產(chǎn)生較好的抑菌活性。本文僅對添加棘孢木霉的黃芪藥渣發(fā)酵液的活性物質(zhì)作了初步的研究，接下來將進(jìn)一步改良菌種，改進(jìn)發(fā)酵工藝，提高各類活性物質(zhì)在發(fā)酵產(chǎn)品中的產(chǎn)量，并擴(kuò)大中藥渣的種類，研制出新型飼料添加劑，以滿足市場的需求。

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（責(zé)任編輯：侯春曉）

S 816.7

：A

：0528-9017（2015）10-1651-03

文獻(xiàn)著錄格式：竺利紅，焦巧芳，尹小良，等.發(fā)酵法制備黃芪藥渣飼料添加劑活性物質(zhì)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1651-1653.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151043

2015-05-14

竺利紅（1973-），女，浙江嵊州人，副研究員，碩士，主要從事微生物農(nóng)藥研究工作。E-mail：zhulh@mail.zaas.ac.cn。

施躍峰。E-mail：shiyf2003@sina.com。