孔 梅，藍(lán)增全*，吳 田

（西南林業(yè)大學(xué)a環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，b園林學(xué)院，云南昆明 650224）

云南野生楊梅快繁體系的建立

孔 梅a，藍(lán)增全a*，吳 田b*

（西南林業(yè)大學(xué)a環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，b園林學(xué)院，云南昆明 650224）

以云南野生楊梅種子為材料，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度及配比的激素，研究楊梅無菌快繁的技術(shù)體系。試驗結(jié)果表明，用20%的次氯酸鈉處理種子，污染率較低，為11.11%；MS+0.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA+6 mg·L-1PVP的培養(yǎng)基有利于芽的增殖，叢生芽最多；MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA+6 mg·L-1PVP的培養(yǎng)基有利于莖節(jié)的生長；1.5 g·L-1的活性炭對楊梅無菌苗的防褐化效果最好，褐化率僅為32%；MS+2.0 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)66.67%。

楊梅；種子；褐化；快速繁殖

楊梅可用實(shí)生、壓條和嫁接方式進(jìn)行繁殖，目前主要采取嫁接方式進(jìn)行繁殖［5］，但是嫁接存活率低，周期長，效率低，難以滿足大規(guī)模的生產(chǎn)化需求［6-7］，因此，建立楊梅快速繁殖技術(shù)體系具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和現(xiàn)實(shí)意義。云南野生楊梅即矮楊梅，其Vc含量高于栽培種，含酸量也高于栽培種，具有很高的開發(fā)價值。本研究以云南野生楊梅為材料，研究其無菌快繁技術(shù)體系，希望為楊梅的大規(guī)模育苗提供科學(xué)依據(jù)和切實(shí)可行的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

楊梅種子采自云南省曲靖市會澤縣礦山鎮(zhèn)水子樹村大包山，地理坐標(biāo)103°18′E，26°25′N，挑選成熟飽滿種子為材料。

1.2 處理設(shè)計

1.2.1 種子的發(fā)芽處理

用冷水浸種48 h后，去殼放入有濾紙的培養(yǎng)皿中待用。在無菌條件下，將濃硫酸預(yù)處理的種子用不同濃度的次氯酸鈉（0%，10%，20%，25%）浸泡4 min，再用75%的酒精浸泡30 s，最后用無菌水清洗3次，接種于MS培養(yǎng)基上。30 d后統(tǒng)計其污染率，污染率/%=污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100。同一處理共3瓶，設(shè)3次重復(fù)試驗。

1.2.2 楊梅無菌苗增殖培養(yǎng)基篩選

孔子說：“知之者不如好之者，好之者不如樂之者?！睈垡蛩固褂终f：“興趣是最好的老師?！边@要求老師在導(dǎo)入新課時，精心設(shè)計問題情景，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和欲望。讓學(xué)生在輕松愉快的學(xué)習(xí)氛圍中積極主動學(xué)習(xí)，教師引導(dǎo)學(xué)生在精心設(shè)計的問題情景中積極探索，體驗每一步求和過程，感受成功喜悅，進(jìn)一步激發(fā)思維創(chuàng)新。

待幼苗長至3～4 cm時，在無菌條件下，切下幼苗帶腋芽的莖段，分別接種于添加不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，共設(shè)計16個組合，每瓶接種4～5個外植體，每組5瓶，60 d后統(tǒng)計并記錄無菌苗增殖情況以及長勢。

1.2.3 活性炭處理

向篩選出的最佳培養(yǎng)基中添加活性炭，使培養(yǎng)基中活性炭的濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0 g·L-1，培養(yǎng)45 d以后，觀察植株褐化及生長情況，并統(tǒng)計褐化率，褐化率/%=褐化苗數(shù)/接種苗數(shù)×100。共設(shè)計5個組合，每個組合3次重復(fù)試驗。

1.2.4 根的誘導(dǎo)

向MS培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的IBA，NAA和IAA，誘導(dǎo)無菌苗生根。共設(shè)計14個組合，每組5瓶，每瓶5～6株外植體，30 d后統(tǒng)計生根率，生根率/%=（生根株數(shù)/接種株數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度次氯酸鈉處理對楊梅種子發(fā)芽的影響

不同濃度次氯酸鈉處理對楊梅種子污染率的影響不同，由表1可知，次氯酸鈉濃度為20%時，污染率最低，為11.11%。因此，楊梅種子發(fā)芽中，次氯酸鈉最佳消毒濃度為20%。

表1 不同濃度次氯酸鈉處理對楊梅種子發(fā)芽的影響

2.2 不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響

不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響不同，詳見表2。當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時，植株莖節(jié)較細(xì)，無菌苗長勢良好，叢生芽較多，為20個，芽長為3 cm，株高為5 cm（圖1中A）。當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg· L-1、NAA的濃度為0.2 mg·L-1時，叢生芽較少，僅有10個，芽長為2 cm，株高為8 cm，葉片較小，節(jié)間較長，莖節(jié)粗，無菌苗長勢良好（圖1中B）。因此，綜合考慮，誘導(dǎo)楊梅無菌苗芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg· L-1NAA+6 mg·L-1PVP；誘導(dǎo)楊梅無菌苗莖節(jié)增高增長的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA+6 mg·L-1PVP。

表2 不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響

圖1 不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響

2.3 不同濃度活性炭對無菌苗褐化與生長的影響

不同濃度活性炭對無菌苗褐化以及生長的影響不同（表3）。當(dāng)活性炭濃度為1.5 g·L-1時，無菌苗褐化率最低，為32%；當(dāng)濃度為2 g·L-1時，褐化率又升高至40%。說明活性炭濃度為1.5 g· L-1時，抑制楊梅無菌苗褐化效果最好。

不同濃度的活性炭對外植體生長的影響也不同，活性炭濃度為0.5 g·L-1時，植株叢生芽少，僅有3個，株高為8 cm，莖節(jié)長，葉片較小且偏黃，植株較纖細(xì)，長勢較差；活性炭濃度為1，1.5，2.0 g·L-1時，植株叢生芽多，植株較矮小，葉片較大，長勢較好，其中活性炭濃度為1.5 g· L-1時，葉片最濃郁茂盛，植株高，前20 d植株長勢較好，但后期枯葉較多。

由此可見，濃度為1.5 g·L-1的活性炭不僅可以有效抑制楊梅無菌苗褐化，還能促進(jìn)植株生長。

2.4 不同激素配比對無菌苗生根誘導(dǎo)的影響

楊梅無菌苗植株纖細(xì)，生根較難，不同激素配比對根誘導(dǎo)的影響各不相同。楊梅無菌苗生根較慢，20 d才開始生根，30 d后統(tǒng)計生根率。結(jié)果（表4）表明，MS+2.0 mg·L-1IBA培養(yǎng)基中的無菌苗生根率較高，達(dá)66.67%，根長且粗壯，長勢較好；MS+1.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中的無菌苗生根率相對較高，為21.82%，根粗，無菌苗長勢好；MS+1.5 mg·L-1IAA培養(yǎng)基中無菌苗生根率較低，為8.93%；培養(yǎng)基中同時添加IBA，NAA和IAA時，無菌苗生根率為47.83%，根粗，無菌苗長勢弱。

綜上所述，IBA對云南野生楊梅無菌苗誘導(dǎo)生根效果比IAA和NAA好，且單激素比激素組合生根率更高。

表3 不同濃度活性炭對無菌苗褐化以及無菌苗生長的影響

表4 不同激素配比對無菌苗生根誘導(dǎo)的影響

3 小結(jié)與討論

利用組織培養(yǎng)進(jìn)行楊梅種苗繁殖，能夠在較短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)健康種苗，為工廠化繁育種苗、降低生產(chǎn)成本以及保存品種優(yōu)良特性等提供了技術(shù)支持。本研究建立了楊梅高效組培再生體系，繁殖系數(shù)高。本研究表明，野生楊梅種子發(fā)芽的最佳次氯酸鈉消毒濃度是20%，污染率為11.11%；誘導(dǎo)楊梅無菌苗芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+ 0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+6 mg·L-1PVP，誘導(dǎo)楊梅無菌苗莖節(jié)生長的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+6 mg· L-1PVP；能有效抑制無菌苗褐化的活性炭濃度為1.5 g·L-1，褐化率可降至32%；無菌苗最適生根培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1IBA，生根后植株生長正常，葉片舒展。

目前，關(guān)于楊梅組織培養(yǎng)的研究報道還比較少，楊梅屬于木本植物，許多木本植物組織培養(yǎng)過程中存在著難以解決的外植體褐變［8］、試管苗玻璃化［9］和生根難［10］等問題。褐化與菌類污染和玻璃化現(xiàn)象并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題［11-13］。木本植物含酚類物質(zhì)，當(dāng)外植體被切割后，切口附近細(xì)胞受到傷害，酚類化合物和多酚氧化物向外流出，酚類化合物被氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又在酪氨酸酶的作用下，使外植體的蛋白質(zhì)聚合，導(dǎo)致培養(yǎng)基褐變，影響外植體的正常生長［14］。李師翁等［15］在沙棘嫩莖的愈傷組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，及時給試驗材料轉(zhuǎn)瓶、更換新鮮培養(yǎng)基（周期不超過4周），可有效降低愈傷組織的褐變，但轉(zhuǎn)瓶次數(shù)不宜太多，一般2～3次為宜。在本研究中，楊梅外植體褐化情況比較嚴(yán)重，培養(yǎng)基中添加了PVP和不同濃度的活性炭，褐化情況得到緩解，但是仍有部分外植體褐化，要完全消除褐化的影響，還需進(jìn)一步試驗研究。此外，試驗中還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的活性炭對無菌苗的增殖以及生長也有一定的影響，但是之前未見報道，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本試驗中，誘導(dǎo)楊梅無菌苗芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)楊梅無菌苗莖節(jié)增高增長的最優(yōu)培養(yǎng)基分別是MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+ 6 mg·L-1PVP和MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA+6 mg·L-1PVP，所用激素的濃度與前人研究結(jié)果有所差異［16］，這可能是因為所用的起始材料品種不同、基因不同、生理狀態(tài)不同等所致，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，在根系誘導(dǎo)過程中，由于培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境、激素和激素濃度等各種因素，會引起的組培苗失活，葉片頂端或整株黃化［17］，本試驗中根系誘導(dǎo)50 d左右，組培苗出現(xiàn)黃化及枯死現(xiàn)象，此時需要及時轉(zhuǎn)瓶，將無菌幼苗轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上，才能保證植株的營養(yǎng)吸收及正常生長。

在木本植物器官發(fā)生過程中，細(xì)胞分裂素和生長素對芽的誘導(dǎo)和生長發(fā)育均起著重要作用，誘導(dǎo)不定芽的形成時，細(xì)胞分裂素用量一般高于生長素的用量或只用細(xì)胞分裂素［18-20］；而誘導(dǎo)不定根時，只用生長素或配合使用較低濃度的細(xì)胞分裂素［21-22］。試驗中對比了不同濃度不同激素對外植體增殖及生長的影響，篩選出了促芽增殖和促莖節(jié)生長以及誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基，這為后續(xù)的楊梅植株離體再生以及遺傳轉(zhuǎn)化試驗奠定了一定的基礎(chǔ)，在生產(chǎn)上也可按條件所需添加不同的激素濃度。

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（責(zé)任編輯：侯春曉）

S 667.6

：A

：0528-9017（2015）10-1557-04

文獻(xiàn)著錄格式：孔梅，藍(lán)增全，吳田.云南野生楊梅快繁體系的建立［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1557-1560.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151008

2015-04-30

國家星火計劃諾麗良種的示范與推廣（2014GA830017）；國家星火計劃金花茶種苗繁育與茶膏加工技術(shù)的示范推廣（2014GA830016）

孔 梅（1990-），女，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向為森林生態(tài)學(xué)。E-mail：1229313040@qq.com。

藍(lán)增全，教授，研究方向為植物生態(tài)學(xué)。E-mail：km lanzengquan@gmail.com；吳 田，副教授，研究方向為植物生物技術(shù)。E-mail：2351417655@qq.com。