（青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點實驗室培育基地，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，青海高原牦牛研究中心，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 81001 6）

穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素在牦牛產(chǎn)地區(qū)分中的應用

項 洋，郝力壯，牛建章，張曉衛(wèi)，柴沙駝*

（青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點實驗室培育基地，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，青海高原牦牛研究中心，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 81001 6）

為確定穩(wěn)定性同位素對牦 牛肉溯源的可行性。利用同位素質(zhì)譜儀測定來自青海省河南縣、大通縣，四川省紅原縣、九龍縣的牦牛肉樣品中粗脂肪的碳同位素及脫脂牦牛肉中的碳、氮、氫同位素。通過比較分析不同地域來源牦牛肉中穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素的組成特征。結(jié)果表明，各地區(qū)牦牛肉不同組織中的穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素存在顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），脫脂牦牛肉中的穩(wěn)定性碳同位素判別效果好于粗脂肪中穩(wěn)定性碳同位素判別效果，同位素指標組合判別效果好于單一同位素指標的判別效果，穩(wěn)定性氮、氫同位素指標組合分析是牦牛肉產(chǎn)地溯源的有效指標，準確率可達到85%。利用穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素指標與多元統(tǒng)計分析方法相結(jié)合可以對不同地域來源的牦牛肉進行有效的區(qū)分。

牦牛肉；溯源；穩(wěn)定性同位素；δ13C；δ15N；δ2H

牦牛是生活在海拔3 000 m以上高寒地區(qū)的特有家畜品種，牦牛肉不僅具有高蛋白、低脂肪，富含礦物元素[1]，且是公認的無污染綠色食品[2]。隨著人們生活水平的提高，綠色有機的特色食品日益受到消費者關(guān)注和喜愛。近年來，由于畜禽源性惡性事件不斷發(fā)生，消費者對動物源性食品安全有了越來越多的擔憂和關(guān)心。因此為了保護牦牛這一特色畜產(chǎn)品，同時方便畜產(chǎn)品質(zhì)量安全與監(jiān)管，亟待解決產(chǎn)地溯源的技術(shù)問題，為牦牛肉優(yōu)質(zhì)優(yōu)價提供技術(shù)支持。

目前，穩(wěn)定性同位素溯源技術(shù)是判別動物源性食品產(chǎn)地的一項很有效的分析手段。孫淑敏[3]研究發(fā)現(xiàn)不同地域羊組織中的δ13C、δ15N值和δ2H值存在顯著差異。Camin等[4]通過分析2005年與2006年羔羊肉中的δ13C、δ15N、δ2H和δ34S數(shù)據(jù)得出，在同一地區(qū)，不同年份的羊肉脫脂蛋白中δ13C、δ15N、δ2H和δ34S有顯著差異。Bahar等[5]共分析了愛爾蘭242 頭牛，研究發(fā)現(xiàn)一年中δ13C、δ15N沒有明顯的變化，而δ34S表現(xiàn)出復雜的季節(jié)性變化。馬冬紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)各地的羅非魚腹肉中的δ2H值可做為有效的溯源指標。王慧文等[7]研究發(fā)現(xiàn)肉雞的飼料與產(chǎn)地與雞肉中δ13C值和δ2H值有關(guān)。此外，一些同位素分析方法已經(jīng)得到官方分析化學家協(xié)會及歐洲標準化委員會的認可[8]。

盡管使用穩(wěn)定性同位素對畜產(chǎn)品[9-13]及乳產(chǎn)品[14-16]溯源已有研究，但不同地域來源牦牛肉中同位素的差異性及同位素是否可作為溯源指標尚未被研究證實。因此，本研究通過對牦牛肉主產(chǎn)區(qū)的4 個不同來源的牦牛肉樣品進行穩(wěn)定性同位素分析，探討各地區(qū)間的穩(wěn)定性同位素的差異，為穩(wěn)定性同位素溯源技術(shù)的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別從青海省大通縣、河南縣、四川省紅原縣、九龍縣4 個地點各隨機采集10 頭牦牛肉背最長?。?0～14 肋骨間）樣品500 g，放入自封袋在-20 ℃冰箱中冷凍保存。

石油醚（60～90 ℃沸程） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機 德國Christ公司；QM-3SP2型行星式球磨儀 南京大學儀器廠；2050 Soxtec型自動索氏提取儀 丹麥Foss公司；vario PYRO cube元素分析儀 德國Elementar公司；100穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀 英國Isoprime公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

冷凍干燥：將樣品切成1 cm3小丁，平鋪在托盤中冷凍干燥48 h取出后放入干燥器中保存。其中，真空冷凍干燥機冷限溫度不大于-62 ℃，真空度不大于10 Pa，相對濕度不大于70%。

粉碎：將凍干后的樣品放入行星式球磨機中進行粉碎，約1 h。其中，行星式球磨機公轉(zhuǎn)頻率44 Hz，轉(zhuǎn)速290 r/min，自轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速580 r/min。

脫脂：稱取2～3 g粉碎好的牦牛肉樣品，放在全自動索氏提取儀中，加入70 mL石油醚（沸程60～90 ℃）。在165 ℃條件下，浸泡30 min，淋洗1 h，溶劑回收10 min，完成以上3 步后將樣品取出，此時為脫脂牛肉樣品及粗脂肪樣品，備用[17]。

1.3.2 穩(wěn)定性碳、氮同位素比率檢測

稱取2～4 mg樣品放入錫箔杯中，通過自動進樣器進入元素分析儀，在其內(nèi)燃燒并還原轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2，CO2再經(jīng)過稀釋器稀釋，最后進入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進行檢測。

元素分析儀條件：燃燒爐溫度1 020 ℃；還原爐溫度600 ℃；載氣（He）流速230 mL/min。

稀釋儀條件：He稀釋壓力4 bar；CO2參考氣壓力4 bar；N2參考氣壓力4 bar。

質(zhì)譜儀條件：用USGS24（δ13CPDB=-16‰）標定鋼瓶CO2參考氣，采用兩點校正，用USGS24和IAEA600（δ13CPDB=-27.5‰）對測定結(jié)果進行校正；用IAEA N1（δ15Nair=0.4‰）標定鋼瓶N2參考氣，用IAEA N1和USGS43（δ14Nair=8.44‰）對測定結(jié)果進行校正。

穩(wěn)定性碳、氮同位素比率分別以δ13C、δ15N表示，其中，穩(wěn)定性碳同位素相對標準為V-PDB，穩(wěn)定性氮同位素相對標準為空氣（air）。

1.3.3 穩(wěn)定性氫同位素比率檢測

稱取0.3 mg樣品裝入銀杯（6 mm×4 mm），平衡72 h，并按順序放入120 位自動進樣器中，利用自動進樣器將樣品送入元素分析儀，高溫裂解生成CO和H2，最后進入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進行檢測。工作參數(shù)：樣品裂解溫度1 450 ℃；He載氣流速120 mL/min；H2參考氣壓力為4 bar；穩(wěn)定性氫同位素比率以δ2H表示，其中，穩(wěn)定性氫同位素相對標準為V-Smow。

穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素測定結(jié)果按下式計算：

式中：R為標準物質(zhì)和樣品中輕重同位素與輕同位素的豐度比，即分別為13C/12C、15N/14N、2H/1H。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan’s多重比較、判別分析、主成分分析、聚類分析。

判別分析采用逐步判別分析，先驗概率選擇“根據(jù)組樣品數(shù)計算”；聚類分析采用系統(tǒng)聚類，其中聚類距離為歐式距離，聚類方法采用離平方和法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地域間牦牛肉中穩(wěn)定性同位素組成差異分析

通過使用同位素質(zhì)譜儀測得河南縣、大通縣、紅原縣及九龍縣4 個縣的牦牛肉中δ13C、δ15N值和δ2H值，結(jié)果如表1所示。4 個地域間牦牛肉粗脂肪中δ13C平均值由大到小依次為：九龍縣＞河南縣＞大通縣＞紅原縣。同時經(jīng)Duncan’s法多重比較發(fā)現(xiàn)，4 個地區(qū)牦牛肉粗脂肪中的δ13C差異均不顯著（P＞0.01），而在P=0.05水平進行差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅原縣和九龍縣牦牛肉粗脂肪中的δ13C差異顯著（P＜0.05），河南縣與大通縣的差異則未達到顯著水平?？梢酝ㄟ^變異系數(shù)看出，4 個地區(qū)中四川紅原縣變異系數(shù)較大，樣品分布不是很均勻。

4 個地域間脫脂牦牛肉中δ13C的平均值由大到小依次為：河南縣＞紅原縣＞九龍縣＞大通縣，與牦牛肉粗脂肪中的δ13C變化趨勢不一致。通過Duncan’s法多重比較發(fā)現(xiàn)紅原縣與其他3 個縣差異顯著（P＜0.05），但九龍縣與青海省兩縣無顯著差異。紅原縣與河南縣及九龍縣差異極顯著（P＜0.01）。四川兩縣樣品的變異系數(shù)均大于青海兩縣，說明青海的數(shù)據(jù)分布較四川兩縣均勻。

4 個地域間脫脂牦牛肉中的δ15N平均值由大到小依次為大通縣＞紅原縣＞九龍縣＞河南縣。經(jīng)Duncan’s法多重比較可看出大通縣、紅原縣無顯著差異（P＞0.05），河南縣、九龍縣無顯著性差異（P＞0.05），但大通縣、紅原縣與河南縣、九龍縣差異顯著（P＜0.05），并且大通縣與九龍縣差異極顯著（P＜0.01）。通過變異系數(shù)可看出青海省大通縣變異系數(shù)最小。

4 個地域間脫脂牦牛肉中δ2H的平均值由大到小依次為大通縣＞河南縣＞紅原縣＞九龍縣。4 個地區(qū)間差異顯著（P＜0.05），河南縣和大通縣與紅原縣和九龍縣差異極顯著（P＜0.01）。四川省九龍縣變異系數(shù)較大可能是其中有2 個樣品數(shù)值與其他樣品相差較大而造成。總體而言，4 個縣中青海省2 個縣變異系數(shù)由大到小排序順序相一致，四川省則有所不同。

表1 不同地域間牦牛肉中穩(wěn)定性同位素組成差異分析Tabllee 11 δ1133CC,, δ1155N aanndd δ2H values of yak meat samples from different regions

2.2 判別分析

2.2.1 單一同位素指標對牦牛肉產(chǎn)地判別分析

從表2的判別分析結(jié)果看出，粗脂肪中穩(wěn)定性碳同位素判別結(jié)果較差，最高的是紅原縣也只達到50%，而河南縣無一判對，整體判別率也只有37.5%，這與粗脂肪中穩(wěn)定性碳同位素組成差異分析結(jié)果相一致。脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性碳同位素判別效果也不是很理想，整體判別也只有42.5%，其中，紅原縣判別效果較好，判別率為80%。不論是粗脂肪中的碳同位素，還是脫脂牦牛肉中的碳同位素，紅原縣的判別率相對其他3 縣判別率都最高，并且脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性碳同位素整體判別率也好于粗脂肪中穩(wěn)定性碳同位素判別率。

脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性氮同位素判別效果只有大通縣和九龍縣判別率為60%，整體判別率僅為37.5%，判別效果不是很理想。脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性氫同位素在3 種同位素中的判別效果最好，判別率最低為70%，最高達到100%，整體判別率高達85%，與脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性氫同位素組成差異分析結(jié)果一致。

表2 單一同位素指標對牦牛肉產(chǎn)地的正確判別率Table 2 Total rate of correct classification of individual isotope indexes for yak meat samples%

2.2.2 同位素指標組合對牦牛肉產(chǎn)地判別分析

表3 同位素指標組合對牦牛肉產(chǎn)地的正確判別率Table 3 Total rate of correct classification of isotope index combinations for yak meat samples%

表3判別分析結(jié)果表明，同位素指標組合判別效果明顯高于單一指標判別效果。河南縣及大通縣穩(wěn)定性氮、氫同位素指標組合判別效果最好；紅原縣則是穩(wěn)定性氮、氫同位素指標組合判別效果最差；九龍縣穩(wěn)定性碳、氮同位素指標組合判別效果極差，只有10%。紅原縣和九龍縣穩(wěn)定性碳、氫同位素及穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素判別效果都較好，都為80%?？傮w而言，穩(wěn)定性碳、氮同位素指標組合判別效果較差，整體判別率只有42.5%。穩(wěn)定性氮、氫同位素指標組合判別效果最好，整體高達85%。

2.3 主成分分析

從同位素組成差異分析及判別分析中可看出脫脂牦牛肉中的3 種同位素分析效果較好，因此選取其作主成分分析。從表4可看出，前2 個主成分累計方差貢獻率達到86.42%，說明前2 個主成分提供了原始變量足夠的信息。第1主成分中主要包含了穩(wěn)定性氮、氫同位素信息，占方差貢獻率的47.78%；第2主成分主要包含了穩(wěn)定性碳同位素的信息，占方差貢獻率的38.65%。

表4 前2 個主成分的累計方差貢獻率Table 4 Cumulative variance contribution rates of the first 2 principal components

用第1、2主成分標準化得分作散點圖，可將青海省及四川省的牦牛肉樣品完全區(qū)分開（圖1）。青海省大通縣牦牛肉樣品第1主成分均為正值；青海省河南縣牦牛肉樣品無論第1主成分還是第2主成分，既有正值也有負值；紅原縣牦牛肉樣品第2主成分為負值；九龍縣牦牛肉樣品第1主成分完全為負值?？梢?，以上提取的2 種主成分可以將不同地區(qū)的牦牛肉樣品區(qū)分開，可以作為有效溯源指標。

圖1 脫脂牦牛肉第1主成分和第2主成分標準化得分散點圖Fig.1 Score scatter plots of the first two principal components for de-fatted yak muscle samples

2.4 聚類分析

圖2 脫脂牦牛肉穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素聚類分析圖Fig.2 Dendrogram forδ13C,δ15N andδ2H cluster analysis of de-fatted yak muscle

在聚類分析中選取了脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素進行聚類分析（圖2）。在距離為5的位置將樹切斷，可將其分為4 類。第1類全部為九龍縣樣品，占樣品總數(shù)量的80%；第2類主要包括大通縣樣品，占樣品總數(shù)量的100%，并且其中含有九龍縣及河南縣樣品各1個；第3類樣品主要是河南縣樣品，占樣品總數(shù)量的90%，其中還包括了紅原縣和九龍縣樣品各1個；第4類全部是紅原縣樣品，占樣品總數(shù)量的90%。從聚類分析中可看出利用脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性碳、氮、氫3 種同位素可將不同地域的牦牛肉樣品區(qū)基本分開，效果較好。

3 討論與結(jié)論

從不同地域間牦牛肉中穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素組成存在顯著和極顯著差異。這可能與地理環(huán)境有關(guān)。青海省河南縣平均海拔3 650 m，并且氣溫日差較大，年平均氣溫為-1.3～1.6 ℃，年平均降水量為597.3～615.6 mm，屬于高原大陸性氣候，土壤分布主要有6 種，即高山沙漠土、高山草甸土、黑鈣土、山地草甸土、灰褐圖、沼澤土[18]。青海省大通種牛場位于達板山南麓，地形較為復雜，海拔3 000～4 000 m左右，年平均氣溫0.5℃，年平均降水量為548.4 mm，境內(nèi)土壤主要有高山寒漠土、灰褐土、高山草甸土等[19]。四川省紅原縣平均海拔3 600 m，四季難以明顯劃分，日照強，太陽輻射強，降水主要集中在5—10月。四川省九龍縣牦牛長期生長在海拔3 600 m以上的地區(qū)，當?shù)貧夂驑O為惡劣，經(jīng)常刮大風、降大雪[20]。由于產(chǎn)地氣候條件的不同使得牦牛肉中穩(wěn)定性同位素組成有各自的地域特征，進而為穩(wěn)定性同位素技術(shù)對牦牛肉產(chǎn)地溯源提供了可能。

與此同時，研究發(fā)現(xiàn)無論是粗脂肪中的同位素還是脫脂牦牛肉中的同位素都可以看出四川省兩縣具有顯著差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），而河南縣和大通縣則未達到顯著水平。利用第1主成分和第2主成分所做的散點圖也可看出四川省兩縣被明顯地區(qū)分開；同時，在聚類分析中四川省兩縣牦牛被聚為2 類，并且毫無交叉。并且鐘金城等[21]也得出相同的研究結(jié)果，根據(jù)微衛(wèi)星位點的等位基因頻率計算了牦牛群體的歐式遺傳距離并繪制樹系統(tǒng)聚類圖，得出九龍縣與紅原縣牦牛的遺傳距離最大，并且聚為2 類。并且該研究通過隨機擴增多態(tài)性和擴增片段長度多態(tài)性標記聚類、染色體特征聚類及血液蛋白Tf和Hb位點基因頻率的聚類也得出相同的結(jié)論。以上方法可將四川省兩縣的牦牛完全區(qū)分開，對于青海省兩縣卻不然。這可能與所食牧草有關(guān)，九龍縣牦牛隨飼草的變化而游牧于高山牧場或谷地半農(nóng)半牧區(qū)之間；麥洼牦牛即分布于紅原縣的牦牛，草地類型主要以高寒草地為主；青海省河南縣及大通縣的牦?？墒衬敛葜饕院瘫究撇轂橹鱗22]。并且，紅原縣脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性碳同位素與青海省兩縣有顯著差異，但九龍縣則與其他兩縣無差異，說明不同縣之間脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性碳同位素組成存在交叉性，這與郭波莉等[23]研究結(jié)果一致。4 個地域間脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性氮同位素組成差異可看出，相同省不同縣之間差異顯著（P＜0.05），這 可能與當?shù)氐牟煌曃骨闆r有關(guān)，并且還受其他方面因素的影響，如土壤類型、飼喂方式等。Piasentier等[24]指出未施用有機肥的土壤和植物中的δ15N值低于施用有機肥的土壤和植物中的δ15N。劉曉玲[25]也發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)δ15N值差異的顯著性可能與所食牧草區(qū)域的土壤類型和固氮類植物比例的不同而不同。2 個省脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性氫同位素組成差異極顯著（P＜0.01），但相同省不同縣之間只是差異顯著（P＜0.05），這可能是相近地區(qū)有相似的經(jīng)度、緯度和降雨有關(guān)，這與劉曉玲等[26]研究結(jié)果一致，研究指出牛組織中的氫同位素與飲水有關(guān)，而水中的氫同位素組成與當?shù)丨h(huán)境密不可分。在判別分析中利用穩(wěn)定性氫同位素判別效果好于其他幾種情況，粗脂肪中穩(wěn)定性碳同位素及脫脂牦牛肉中穩(wěn)定性氮同位素判別效果較差；穩(wěn)定性同位素指標組合分析判別效果遠好于單一同位素判別效果。

綜上所述，通過以上分析可以看出，使用穩(wěn)定性同位素指紋分析技術(shù)與多元統(tǒng)計分析方法相結(jié)合可以對不同地域來源的牦牛肉進行有效的區(qū)分，牦牛肉中穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素可作為有效的溯源指標，用于牦牛溯源數(shù)據(jù)庫的建立。

不同地域來源的牦牛肉中的穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素呈顯著差異（P＜0.05），且不同省之間脫脂牦牛肉中的穩(wěn)定性碳、氮、氫同位素呈極顯著差異（P＜0.01）。通過判別分析、主成分分析、聚類分析可看出，利用碳、氮、氫3 種同位素指標可以對牦牛肉產(chǎn)地來源進行區(qū)分，但單一同位素指標除氫同位素判別率較高以外，其他同位素判別率較低，因此建議在以后的溯源中選取有效指標組合分析來提高判別率。通過與多元統(tǒng)計方法相結(jié)合分析可看出利用穩(wěn)定性同位素對牦牛肉溯源是可行的。

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Stable Isotope Distribution of Carbon, Nitrogen and Hydrogen in Yak Meat from Different Regions

XIANG Yang, HAO Lizhuang, NIU Jianzhang, ZHANG Xiaowei, CHAI Shatuo*

(State Key Laboratory of Cultivating Base of Plateau Grazing Animal Nutrition and Ecology of Qinghai Province, Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province, Qinghai Plateau Yak Research Center, Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine, Xining 810016, China)

This study aimed to confi rm the possible traceability of yak meat samples from different regions using stable isotopes. The δ13C, δ15N, and δ2H values of yak meat samples (muscle crude fat and de-fatted muscle) from Henan county and Datong county of Qinghai province, and Hongyuan county and Jiulong county of Sichuan province were tested using isotope ratio mass spectrometry (IRMS). The composition characteristics of δ13C, δ15N, and δ2H of yak meat samples were compared and analyzed. The results demonstrated that the δ13C, δ15N, and δ2H differed signifi cantly among meat samples from different yak tissues (P < 0.05 or P < 0.01). The distinguishing capacity for de-fatted muscle was better than for muscle crude. When the indicators of stable isotope were taken into comprehensive consideration, yak meat samples from different places was better distinguished as compared to the individual indicators, and the combined analysis of stable nitrogen and hydrogen isotopes provided potential indicators for tracing the origin of yak meat samples with an accuracy up to 85%. It is a promising approach to classify yak meat based on δ13C, δ15N and δ2H combined with multivariate statistical methods.

yak; traceability; stable isotope; δ13C; δ15N; δ2H

TS251.5

A

1002-6630（2015）12-0191-05

10.7506/spkx1002-6630-201512035

2014-08-21

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（2012CB722906）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD13B01）；青海省重大科技平臺建設項目（2011-Z-Y12A；2012-Z-Y08）

項洋（1988—），女，碩士研究生，研究方向為牦牛肉溯源技術(shù)。E-mail：chaorenxy@163.com

*通信作者：柴沙駝（1968—），男，副研究員，本科，研究方向為反芻動物營養(yǎng)與生產(chǎn)。E-mail：chaishatuo@163.com