（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

頂空固相微萃取分析金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的條件優(yōu)化

史 輝，唐俊妮，陳 娟*，王 瓊

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

采用65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭和50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭，20、30 min和40 min 3 種萃取時(shí)間，50、65 ℃和80 ℃ 3 種萃取溫度，分別對(duì)金黃色葡萄球菌胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行萃取，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，以建立適宜于金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物的萃取分析方法。結(jié)果表明，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭能更好地滿足各類化合物的萃取需要，獲得更加全面的化合物信息，并且在萃取溫度80 ℃條件下萃取30 min，得到的金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物的數(shù)量和響應(yīng)強(qiáng)度較高。因此，萃取金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的最適條件為：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取溫度80 ℃、萃取時(shí)間30 min。在該萃取條件下，檢測(cè)出金黃色葡萄球菌在TSB中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)為乙醇、1-癸醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸等。該萃取方法的建立可為細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的分析提供參考。

金黃色葡萄球菌；揮發(fā)性代謝產(chǎn)物；萃取條件；優(yōu)化；頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是細(xì)菌代謝產(chǎn)物的重要組成部分，與細(xì)菌生命活動(dòng)和細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量密切關(guān)聯(lián)，是細(xì)菌與周圍各種生物進(jìn)行交流的重要信息素[1]。大多數(shù)細(xì)菌釋放的揮發(fā)性代謝物都具有微生物種屬特異性，意味著在某些情況下，揮發(fā)性特征或某些典型化合物能夠作為檢測(cè)和鑒別細(xì)菌的生物標(biāo)志[2-3]。在臨床醫(yī)學(xué)上，細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物作為一種新的檢測(cè)靶標(biāo)，成為了診斷細(xì)菌感染的有效方法[4-5]。近年來(lái)，基于揮發(fā)性化合物分析的氣味指紋技術(shù)在食品中的應(yīng)用越來(lái)越活躍。食品營(yíng)養(yǎng)豐富，是微生物生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基，容易受微生物污染，其次級(jí)代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生特定的揮發(fā)性氣味物質(zhì)，基于這點(diǎn)可利用氣味指紋技術(shù)來(lái)檢測(cè)食品中的微生物[6]。金偉平等[7]運(yùn)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectroscopy，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)單增李斯特菌污染的冷藏牛肉所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，尋找到單增李斯特菌污染牛肉的特征性氣味物質(zhì)包括苯甲醛、二叔丁基對(duì)甲酚和十六烷。Holm等[8]也采用HSSPME-GC-MS技術(shù)對(duì)污染了熱殺索絲菌、淺黃金色單胞菌和肉桿菌的干臘腸的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)二乙酰、3-羥基-2-丁酮、2-（或3-）甲基丁醇、2-（或3-）甲基丁醛和2-甲基丙醇等物質(zhì)與干臘腸的腐敗性感官指標(biāo)緊密相關(guān)。Tait等[9]通過(guò)β-葡萄糖苷酶和馬尿酸酶水解底物產(chǎn)生2-硝基苯酚和3-氟苯胺的方式，經(jīng)HS-SPMEGC-MS檢測(cè)牛奶是否受到單核增生李斯特菌的污染，方法的檢測(cè)限達(dá)到1×102～1.5×102CFU/mL牛奶（過(guò)夜培養(yǎng)之前）。這些報(bào)道都是應(yīng)用氣味指紋技術(shù)檢測(cè)食品中污染微生物的探索性研究。由于食品中微生物種類復(fù)雜，并且食品基質(zhì)不同于簡(jiǎn)單的肉湯培養(yǎng)基，因此，擬通過(guò)氣味特征檢測(cè)食品中污染的微生物需要做大量的研究工作，包括全面分析食品中目標(biāo)菌和背景菌各自的揮發(fā)性物質(zhì)，目標(biāo)菌和背景菌相互作用的揮發(fā)性物質(zhì)，以及細(xì)菌生長(zhǎng)情況與揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生情況的相關(guān)性等。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，可引起人和動(dòng)物的多種疾病，如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎和奶牛乳房炎等，它是社區(qū)和醫(yī)院感染疾病中發(fā)病率和死亡率最高的病原菌[10]。對(duì)于食品安全而言，金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病據(jù)估計(jì)在美國(guó)每年可暴發(fā)241 000 例[11]。我國(guó)由細(xì)菌引起的食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌污染的食物比例可占到32.5%[12]。目前，檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)法和基于分子生物學(xué)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。有關(guān)金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的研究不多，已有文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道了金黃色葡萄球菌在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，以及耐受型和敏感型甲氧西林金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之間的差異[15]等，但由于采用的菌株、培養(yǎng)基質(zhì)和分析條件等方面的差異，目前關(guān)于應(yīng)用氣味指紋技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法還有待詳細(xì)探索。

SPME是近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的一種樣品前處理技術(shù)，具有萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體、操作簡(jiǎn)便、靈活和靈敏度高等特點(diǎn)[16]。SPME與GC-MS聯(lián)用結(jié)合形成HSSPME-GC-MS分析技術(shù)，該技術(shù)是分析細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的主要方法之一[17]。萃取頭的選擇與萃取條件的優(yōu)化是影響揮發(fā)性代謝物分析的關(guān)鍵。然而，目前僅見(jiàn)少量文獻(xiàn)[15,18]報(bào)道了萃取方式對(duì)細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物萃取效果的影響。本研究采用不同的萃取頭、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌在胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝物進(jìn)行萃取，經(jīng)GC-MS方法檢測(cè)。通過(guò)比較不同萃取條件對(duì)金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的萃取差異，確定最適宜的萃取條件，使得GC-MS分析檢測(cè)獲得的信息更全面，化合物在質(zhì)譜中的響應(yīng)強(qiáng)度更高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析方法的研究將為氣味指紋技術(shù)在食品微生物檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌菌株S. aureus ATCC 6538由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；TSB 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace DSQ型GC-MS聯(lián)用儀（配Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國(guó)Thermo公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/ DVB）萃取頭、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭和75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭 美國(guó)Supelco公司；MOF-4086S低溫冰箱、MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備

吸取金黃色葡萄球菌貯藏菌液50 μL接種入6 mL TSB培養(yǎng)基中，于37 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)16 h。再吸取金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物接入150 mL TSB中，使初始接種量為100～200 CFU/mL，于37 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)12～14 h，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。吸取該培養(yǎng)物5 mL轉(zhuǎn)入20 mL頂空瓶?jī)?nèi)，同時(shí)加入2 g氯化鈉，加蓋密封，作為測(cè)試樣品。

1.3.2 萃取實(shí)驗(yàn)

在萃取溫度80 ℃、萃取時(shí)間30 min條件下，分別采用65 μm PDMS/DVB萃取頭、75 μm CAR/PDMS萃取頭和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行萃取。重復(fù)3 次。

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取時(shí)間30 min條件下，分別采用50、65 ℃和80 ℃ 3 種萃取溫度進(jìn)行萃取。重復(fù)3 次。

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在萃取溫度80 ℃條件下，分別采用20、30 min和40 min 3 種萃取時(shí)間進(jìn)行萃取。重復(fù)3 次。

在優(yōu)化得到的最適萃取條件下，測(cè)定未接種金黃色葡萄球菌的TSB培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照。

1.3.3 分析條件

GC條件：HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式，不分流1 min之后分流比為50∶1；流速1 mL/min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min升溫至280 ℃并保持3 min；載氣為99.999%氦氣；進(jìn)樣口溫度230 ℃；解吸時(shí)間2 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍40～500 u。

1.3.4 定性與定量

MS結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢索（NIST 08）進(jìn)行定性分析，同時(shí)由Xcalibur軟件系統(tǒng)完成手動(dòng)對(duì)照檢索，要求正反向匹配因子均大于850，可能性大于60%。利用面積歸一法計(jì)算已鑒定揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量，采用提取離子流方式報(bào)告代表性揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積。揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的計(jì)算按下式進(jìn)行：

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的選擇

圖1 3 種萃取頭條件下金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物萃取數(shù)量（A）、相對(duì)含量（B）的比較Fig.1 Comparison of the composition of volatile metabolites fromS. aureusby using three fibers

由圖1可知，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對(duì)金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行萃取，共鑒定出34 個(gè)化合物，其中醇類12 個(gè)、醛類8 個(gè)、酮類4 個(gè)、酸類4 個(gè)、酯類2 個(gè)、含硫和含氮化合物2 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)和其他2 個(gè)，分別占已檢出揮發(fā)性成分總含量的43.08%、30.66%、10.86%、7.13%、3.69%、2.01%、0%和2.56%。在采用65 μm PDMS/DVB萃取頭對(duì)金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行萃取，共鑒定出40 個(gè)化合物，其中醇類11 個(gè)、醛類8 個(gè)、酮類5 個(gè)、酸類7 個(gè)、酯類3 個(gè)、含硫和含氮化合物3 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)和其他2 個(gè)，分別占已檢出揮發(fā)性成分總含量的41.85%、25.16%、4.34%、11.61%、6.16%、4.83%、0.60%和5.45%。采用75 μm CAR /PDMS萃取頭對(duì)金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行萃取，共鑒定出30 個(gè)化合物，其中醇類9 個(gè)、醛類9 個(gè)、酮類3 個(gè)、酸類1 個(gè)、酯類2 個(gè)、含硫和含氮化合物2 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)和其他2 個(gè)，分別占已檢出揮發(fā)性成分總含量的33.41%、30.84%、27.40%、0.76%、6.85%、0.34%、0.18%和0.22%。對(duì)于醇類和醛類化合物，3 種萃取頭萃取的物質(zhì)數(shù)量和相對(duì)含量都較高，對(duì)這2 類化合物有較好的萃取效果。對(duì)于酮類化合物，3 種萃取頭萃取的物質(zhì)數(shù)量相當(dāng)，在相對(duì)含量上，75 μm CAR/PDMS萃取頭＞50/30 μm DVB/CAR/ PDMS萃取頭＞65 μm PDMS/DVB萃取頭；對(duì)于酸類化合物，在數(shù)量和相對(duì)含量上，65 μm PDMS/DVB萃取頭＞50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭＞75 μm CAR/PDMS萃取頭。結(jié)果表明，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對(duì)于酮類和酸類化合物的萃取能力介于其他2 種萃取頭之間。對(duì)于酯類、含硫、含氮化合物和碳?xì)浠衔铮? 種萃取頭萃取的物質(zhì)數(shù)量和相對(duì)含量都較低，且萃取效果差異較小。為滿足各類化合物的萃取需要，以獲得較全面的物質(zhì)信息，選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行萃取較為適宜。

2.2 萃取溫度的選擇

圖2 3 種萃取溫度條件下金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)量比較Fig.2 Comparison of the numbers of volatile metabolites fromS. aureusat three extraction temperatures

表1 3 種萃取溫度條件下金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物的峰面積比較Table 1 Comparison of volatile metabolites peak areas of S. aureus at three extraction temperatures

從圖2可以看出，萃取溫度為50 ℃時(shí)，共萃取出42 個(gè)物質(zhì)，其中醇類13 個(gè)、醛類7 個(gè)、酮類7個(gè)、酸類2 個(gè)、酯類3 個(gè)、含硫和含氮化合物6 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)、其他2 個(gè)；萃取溫度為65 ℃時(shí)，共萃取出44 個(gè)物質(zhì)，其中醇類15 個(gè)、醛類9 個(gè)、酮類6 個(gè)、酸類2 個(gè)、酯類2 個(gè)、含硫和含氮化合物6 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)、其他2 個(gè)；萃取溫度為80 ℃時(shí)，共萃取出47 個(gè)物質(zhì)，其中醇類16 個(gè)、醛類9 個(gè)、酮類4 個(gè)、酸類7 個(gè)、酯類1 個(gè)、含硫和含氮化合物6 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)、其他3 個(gè)。在50、65 ℃和80 ℃ 3 種萃取溫度條件下，金黃色葡萄球菌各類揮發(fā)性代謝物的數(shù)量差異較小，但從萃取物質(zhì)總量來(lái)看，80 ℃萃取物質(zhì)數(shù)量最高，這說(shuō)明隨著萃取溫度的升高，萃取得到的物質(zhì)數(shù)量增加。其次，從眾多揮發(fā)性代謝物中篩選出20 種代表性化合物，采用提取離子流方式獲得峰面積，從化合物響應(yīng)強(qiáng)度上比較3 種萃取溫度差異。由表1可知，隨著萃取溫度的升高，大多數(shù)揮發(fā)性代謝物峰面積都不斷上升，3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、乙醇、乙酸、3-羥基-2-丁酮和丙酮的峰面積變化不明顯，僅3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇的峰面積不斷下降。因此，在萃取溫度80 ℃條件下，萃取得到的金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物的數(shù)量和響應(yīng)強(qiáng)度都較高。

2.3 萃取時(shí)間的選擇

圖3 3 種萃取時(shí)間條件下金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)量比較Fig.3 Comparison in the numbers of volatile metabolites ofS. aureusby using three extraction times

從圖3可以看出，萃取時(shí)間為20 min時(shí)，共萃取出46 個(gè)物質(zhì)，其中醇類15 個(gè)、醛類9 個(gè)、酮類5個(gè)、酸類4 個(gè)、酯類2 個(gè)、含硫和含氮化合物7 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)、其他3 個(gè)；萃取時(shí)間為30 min時(shí)，共萃取出47 個(gè)物質(zhì)，其中醇類15 個(gè)、醛類9 個(gè)、酮類4 個(gè)、酸類7 個(gè)、酯類2 個(gè)、含硫和含氮化合物6 個(gè)、碳?xì)浠衔?個(gè)、其他3 個(gè)；萃取時(shí)間為40 min時(shí)，共萃取出45 個(gè)物質(zhì)，其中醇類14 個(gè)、醛類9個(gè)、酮類4 個(gè)、酸類6 個(gè)、酯類2 個(gè)、含硫和含氮化合物6 個(gè)、碳?xì)浠衔? 個(gè)、其他3 個(gè)。在20、30 min和40 min 3 種萃取時(shí)間條件下，金黃色葡萄球菌各類揮發(fā)性代謝物的數(shù)量差異較小，且揮發(fā)性代謝物的總數(shù)量相近。從表2可以得出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，2-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、乙酸和吲哚的峰面積呈下降趨勢(shì)，但下降程度不大。萃取時(shí)間在20～30 min之間，苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、1-辛醇、1-癸醇、3-甲基丁酸、正辛酸、正癸酸、十二烷酸、2-壬酮和2-十一酮的峰面積呈上升趨勢(shì)，且上升程度明顯；萃取時(shí)間在30～40 min之間，這些物質(zhì)的峰面積變化較小。因此，綜合考慮檢測(cè)到的揮發(fā)性代謝物的數(shù)量和響應(yīng)強(qiáng)度，選擇萃取時(shí)間30 min較好。

表2 3 種萃取時(shí)間條件下金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物的峰面積比較Table 2 Comparison of volatile metabolites peak areas of S. aureus at three extraction times

2.4 最適萃取條件下金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)

表3 最適萃取條件下金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)Table 3 Volatile compounds produced byS. aureus under the optimal extraction conditions

從TSB空白培養(yǎng)基中檢測(cè)出大量醛類物質(zhì)如3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛，發(fā)現(xiàn)它們的響應(yīng)強(qiáng)度接近或大于在金黃色葡萄球菌TSB培養(yǎng)物中的響應(yīng)強(qiáng)度，因此，確定檢測(cè)出的醛類物質(zhì)不是由金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)代謝活動(dòng)所產(chǎn)生。從表3可以看出，在TSB空白培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)出3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸、3-甲基丁酸、正辛酸、2-十一酮和3-羥基-2-丁酮，說(shuō)明這些物質(zhì)是由于金黃色葡萄球菌在TSB中生長(zhǎng)代謝所產(chǎn)生；其他物質(zhì)雖然在TSB空白培養(yǎng)基中被檢測(cè)出，同樣由于金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，使得這些物質(zhì)在金黃色葡萄球菌TSB培養(yǎng)物中的響應(yīng)強(qiáng)度有所增加。在金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，乙醇的響應(yīng)強(qiáng)度最高，達(dá)到9×109；其次為1-癸醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸的響應(yīng)強(qiáng)度為108，其余物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度為107。因此，在本實(shí)驗(yàn)建立的萃取條件下，金黃色葡萄球菌在TSB中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)包括乙醇、1-癸醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸等。

3 討 論

HS-SPME法萃取揮發(fā)性物質(zhì)受到不同萃取頭的差異、樣品的萃取時(shí)間和萃取溫度等因素的影響。同時(shí)在萃取頭進(jìn)樣時(shí)，由于GC進(jìn)樣口熱解吸的時(shí)間、溫度和分流或不分流的進(jìn)樣模式等均會(huì)影響到分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和分析物的色譜保留時(shí)間、峰形[19]。本實(shí)驗(yàn)以萃取頭類型、萃取時(shí)間和萃取溫度進(jìn)行單因素優(yōu)化。采用纖維萃取頭的固定相或吸附劑包括非極性的PDMS，弱極性的DVB和弱極性的CAR。65 μm PDMS/DVB萃取頭是由聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯復(fù)合材料涂布石英纖維而成，75 μm CAR/PDMS萃取頭是由碳分子篩和聚二甲基硅氧烷復(fù)合材料涂布石英纖維而成，50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭則是由二乙烯苯、碳分子篩和聚二甲基硅氧烷復(fù)合材料涂布石英纖維而成。因此，可以看出，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭的固定相材料包含了其他2 種萃取頭的固定相材料，50/30 μm DVB/CAR/ PDMS萃取頭對(duì)化合物極性的萃取要求具有更低的選擇性，萃取適應(yīng)性更為廣泛。此外，75 μm CAR/PDMS萃取頭適宜小分子質(zhì)量化合物的萃取，而50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭和65 μm PDMS/DVB萃取頭萃取的物質(zhì)分子質(zhì)量范圍比較寬，能萃取到較大分子質(zhì)量化合物。例如，正十四酸（相對(duì)分子質(zhì)量228）和正十六酸（相對(duì)分子質(zhì)量256）在選用65 μm PDMS/DVB萃取頭得到的萃取物中被檢出，而在選用75 μm CAR/PDMS萃取頭得到的萃取物中未被檢出。異雪松醇（相對(duì)分子質(zhì)量222）和7,9-二叔丁基-1-氧雜螺（4,5）癸烯二酮（相對(duì)分子質(zhì)量276）在選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭得到的萃取物中被檢出，而選用75 μm CAR/PDMS萃取頭得到的萃取物中未被檢出。Jia等[15]采用75 μm CAR/ PDMS萃取頭萃取，檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和敏感型金黃色葡萄球菌MH肉湯培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)敏感型金黃色葡萄球菌產(chǎn)生乙醇、1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醛、丙醛、乙酸、丙酸和3-甲基丁酸等。在實(shí)驗(yàn)中，用該萃取頭對(duì)金黃色葡萄球菌TSB培養(yǎng)物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行萃取，也檢出了許多小分子質(zhì)量的醇、醛和酸等化合物，而對(duì)大分子物質(zhì)的萃取效果較差，與Jia等[15]報(bào)道的結(jié)果吻合。

研究結(jié)果得出，金黃色葡萄球菌在TSB中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)包括乙醇、1-癸醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸等。Filipiak等[14]在檢測(cè)金黃色葡萄球菌TSB培養(yǎng)物時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)出長(zhǎng)鏈脂肪醇和甲基酮類，但檢測(cè)出含量較高的物質(zhì)有乙醇、3-甲基-1-丁醇、羥基丙酮、羥基丁酮、2,3-二丁酮、乙酸、異戊酸、乙醛、3-甲基-丁醛和2-甲基-丙醛。Elgaali等[20]在金黃色葡萄球菌TSB培養(yǎng)物中同樣也未檢出長(zhǎng)鏈脂肪醇，酮類物質(zhì)僅檢測(cè)出C13烯酮。Bos等[21]綜述前人研究報(bào)道，提出異戊酸和2-甲基-丁醛可以作為金黃色葡萄球菌的代表性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，醛類物質(zhì)不是由金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)所產(chǎn)生的特異性物質(zhì)，而是TSB培養(yǎng)基的揮發(fā)性物質(zhì)；異戊酸是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的物質(zhì)，但其響應(yīng)強(qiáng)度較低。本研究結(jié)果與報(bào)道的結(jié)果有相似之處但也有差異，原因可能在于測(cè)試的菌株不同。另一方面，TSB培養(yǎng)基作為空白產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)在已報(bào)道的研究中沒(méi)有被扣除。此外，萃取條件也存在差異。Elgaali等[20]采用的萃取條件是100 μm PDMS萃取頭，在32 ℃條件下萃取15 min。Filipiak等[14]采用的萃取條件是75 μm CAR/PDMS萃取頭，37 ℃條件下萃取10 min。通過(guò)單因素試驗(yàn)，階段性選擇最優(yōu)條件后，得到適宜于金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝物萃取的條件為采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取溫度80 ℃、萃取時(shí)間30 min。本研究建立的HSSPME-GC-MS分析方法可以獲得較全面的金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物組成信息。

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Optimization of Headspace Solid Phase Micro-Extraction Conditions for GC-MS Analysis of Volatile Metabolites from Staphylococcus aureus

SHI Hui, TANG Junni, CHEN Juan*, WANG Qiong
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Volatile metabolites from Staphylococcus aureus cultured with tryptone soy broth (TSB) were extracted under different conditions namely three types of fi ber (65 μm PDMS/DVB fi ber, 75 μm CAR/PDMS fi ber and 50/30 μm DVB/ CAR/PDMS fiber), three extraction times (20, 30 and 40 min) and three extraction temperatures (50, 65 and 80 ℃), respectively. The extracts were detected by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The optimal extraction conditions were determined. The results indicated that 50/30 μm DVB/CAR/PDMS fi ber was suitable for the extraction of various components and more comprehensive information was obtained using this fi ber. Abundant amounts and response intensities of bacterial volatile metabolites were extracted at 80 ℃ for 30 min. Accordingly the optimal extraction conditions for volatile metabolites from S. aureus were obtained. Using the established extraction method, the main volatile compounds produced by S. aureus cultured in TSB were detected to be alcohol, 1-decanol, 3-hydroxy-2-butanone, acetone, acetic acid, benzyl alcohol, 3-methyl-1-butanol, indole, 1-octanol and octanoic acid. This extraction method can provide a valuable tool for the analysis of bacterial volatile metabolites.

Staphylococcus aureus; volatile metabolites; extraction condition; optimization; headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectroscopy (HS-SPME-GC-MS)

TS201.6

A

1002-6630（2015）12-0185-06

10.7506/spkx1002-6630-201512034

2014-10-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371781）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（NCET-11-0847）；

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2014SP263）

史輝（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：823371756@qq.com

*通信作者：陳娟（1980—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c食品安全。E-mail：chenj1221@126.com