劉延平，于薈，馬文平，王魯霞，李建新

(菏澤市產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測研究院食品檢驗(yàn)中心，山東菏澤 274000)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定油用牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量

劉延平，于薈，馬文平，王魯霞，李建新

(菏澤市產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測研究院食品檢驗(yàn)中心，山東菏澤 274000)

建立氣相色-譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定油用牡丹花蕊及花粉中角鯊烯含量的方法。牡丹花蕊及花粉經(jīng)索氏抽提法提取脂肪后，用氫氧化鉀-乙醇溶液皂化，石油醚萃取凈化，正己烷溶解，提取物經(jīng)HP-5MS柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：油用牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量分別為2.73，1.75 g／kg。在0.08～400 mg／L范圍內(nèi)角鯊烯含量與定量離子m／z69的峰面積線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，方法的檢出限為11 ng／kg。在1.00～3.00 g／kg范圍內(nèi)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率為92.5%～102.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～5.3%(n=6)。該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，適用于油料植物和植物油中角鯊烯含量的測定。

油用牡丹；牡丹花蕊；牡丹花粉；角鯊烯；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

角鯊烯(化學(xué)名為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物，為無色或黃色透明油狀液體，是從深海鯊魚肝油中提煉而成［1-5］。它具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、促進(jìn)新陳代謝、提高機(jī)體免疫力、降低血清總膽固醇、防止動脈粥樣硬化［6-7］和抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能，是一種無毒性的生物活性物質(zhì)［8-9］，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等相關(guān)領(lǐng)域［10-11］。Bakes M J［12］指出角鯊烯主要來源于深海鯊魚肝油，植物性產(chǎn)品橄欖油中角鯊烯含量也較高［13］。

牡丹是我國特有的木本名貴花卉，其花大、色艷、型美、香濃，極具觀賞性，不僅花美，其根可入藥，稱為“丹皮”，具有清熱涼血、活血化瘀的功效［14］，因此，牡丹一直被用作觀賞花卉和藥用植物。牡丹籽油是由油用牡丹種籽生產(chǎn)的一種新型木本植物油，其不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，其中α-亞麻酸占40%以上，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。國務(wù)院指出要大力發(fā)展木本油料產(chǎn)業(yè)，加快推進(jìn)牡丹籽油生產(chǎn)基地建設(shè)，開發(fā)利用新的木本植物油資源，實(shí)現(xiàn)牡丹產(chǎn)業(yè)化。伴隨著油用牡丹大規(guī)模種植，大量牡丹副產(chǎn)物—牡丹花蕊和花粉引起了人們的關(guān)注，成為了中國特有的營養(yǎng)產(chǎn)品，如不能加以利用將會造成資源大量浪費(fèi)。牡丹不產(chǎn)花蜜，為風(fēng)媒木本植物，因此牡丹花粉不被蜜蜂等其它昆蟲采收污染，質(zhì)量好、產(chǎn)量高。由牡丹花蕊沖泡的茶，色澤金黃，清香宜人［15］，初步試服結(jié)果表明，牡丹花蕊對男性前列腺疾病有獨(dú)特效果。牡丹花蕊、花粉營養(yǎng)價(jià)值極高，但是對其含有的生物活性物質(zhì)的研究，國內(nèi)外很欠缺，成分的研究也只是局限于某類成分的總體分析，并未對單體成分進(jìn)行定量。因此筆者選擇了合適的分離提取技術(shù)提取牡丹花蕊和花粉中的天然功效成分角鯊烯，并對其進(jìn)行了定性和定量分析，目前國內(nèi)外還沒有這方面研究的報(bào)道。筆者建立了樣品皂化后，經(jīng)石油醚萃取凈化，正己烷溶解，氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行牡丹花蕊和花粉中功能性成分角鯊烯含量的定量檢測方法。與毛多斌［16］和謝勇［17］的研究相比，本方法優(yōu)于用正己烷溶解后直接進(jìn)樣，因?yàn)橹苯舆M(jìn)樣干擾大，峰型容易變形，且對氣相的襯管、毛細(xì)管柱以及質(zhì)譜檢測器污染大。由于角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物［18］，因此筆者先將油脂皂化脫脂，然后用石油醚萃取提取角鯊烯。該方法重現(xiàn)性好，靈敏度高，峰型尖銳且干擾峰少，目標(biāo)峰分離效果好，定量準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀(7890A型)串聯(lián)質(zhì)譜儀(5975C型)：美國安捷倫科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52AA型，菏澤市鑫源儀器儀表有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：XMTD-4000型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子天平：AL204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

角 鯊 烯 標(biāo) 準(zhǔn) 品：99.5%，0.5 mL／支，批 號140721-200601，中國藥品生物制品檢定所；

正己烷：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

石油醚：分析純，沸程30～60℃，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

KOH：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

NaCl、無水硫酸鈉、無水乙醇：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

牡丹花蕊和花粉：山東菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司。

1.2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加適量正己烷，振蕩超聲使之完全溶解，再用正己烷定容至標(biāo)線，混勻，制成濃度為1 000 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備

利用1 000 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制0.04～800 mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，進(jìn)行線性和檢出限實(shí)驗(yàn)。

1.4 樣品處理

按照國標(biāo)GB／T 5009.6-2003中第一法索氏抽提法提取花蕊和花粉中的脂肪。稱取0.2 g左右所提取的脂肪樣品，放入50 mL錐形瓶中，加入25 mL的2 mol／L KOH-乙醇溶液，置于85℃恒溫水浴鍋中皂化1 h，冷卻后轉(zhuǎn)移至150 mL分液漏斗中，分別加入25 mL飽和氯化鈉溶液和石油醚，振蕩萃取1 min，靜置分層后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入150 mL分液漏斗中，下層皂化液再分別用25 mL和15 mL石油醚萃取兩次，將合并的3次萃取液用去離子水洗至中性，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，于30℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷定容至10 mL，取上清液用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)柱(30 m×250 μm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；升溫程序：200℃保持0 min，以40℃／min升至280℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：280℃；載氣：高純氦氣，流量為1.0 mL／min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；采集模式：選擇離子監(jiān)測；溶劑延遲：3.00 min；定量離子：m／z69；定性離子：m／z81，95，137。

2 結(jié)果與討論

2.1 角鯊烯的定性與定量離子選擇

對角鯊烯標(biāo)樣通過質(zhì)譜全掃描模式得到質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11.L做相似度檢索匹配度為99%，確定其主要的碎片離子的質(zhì)荷比m／z69，81，95，137，再設(shè)置選擇離子監(jiān)測模式，選擇檢測離子為m／z69，81，95，137。在選擇離子監(jiān)測模式對目標(biāo)物進(jìn)行定量時，通常選擇靈敏度高且抗擾能力強(qiáng)的碎片離子作為目標(biāo)物定量的離子，實(shí)驗(yàn)選擇定量離子為m／z69，定性離子為m／z81，95，137。角鯊烯的總離子流圖和質(zhì)譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

圖2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖

2.2 樣品中角鯊烯的定性與定量

通過與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間和面積相對比，確定樣品中角鯊烯的含量。牡丹花蕊和花粉提取的脂肪中角鯊烯的總離子流圖分別見圖3、圖4，質(zhì)譜圖分別見圖5、圖6。

圖3 牡丹花蕊的總離子流圖

圖4 牡丹花粉的總離子流圖

從圖3、圖4可以看出，樣品中角鯊烯色譜峰基線穩(wěn)定，目標(biāo)峰峰型尖銳，重現(xiàn)性好，并能與其它干擾峰較好地區(qū)分開來。由圖5和圖6的質(zhì)譜峰可以看出提取物的質(zhì)譜峰與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜峰相近，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11.L做相似度檢索匹配度為96%，因此可以確定提取物是角鯊烯。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對樣品中的角鯊烯進(jìn)行定量。

圖5 牡丹花蕊的質(zhì)譜圖

圖6 牡丹花粉的質(zhì)譜圖

2.3 色譜條件選擇

由于角鯊烯是一種高度不飽和烴類化合物，相對分子質(zhì)量大，沸點(diǎn)高(280℃)，難揮發(fā)，故選用HP-5MS非極性耐高溫(325℃)毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度280℃，分離效果好，峰型尖銳，干擾少，此色譜條件適用于角鯊烯的測定。

2.4 線性方程、線性范圍和檢出限

利用1 000 mg／L的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成0.04，0.08，0.16，0.40，1.60，4.00，8.00，16.00，40.00，80.00，120.00，400.00 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.04和800 mg／L這兩個點(diǎn)偏離了線性范圍，因此方法的線性范圍是0.08～400 mg／L。按照設(shè)定的色譜條件，以角鯊烯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子m／z69的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y=9.962×105x-9.816×105，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。當(dāng)信噪比(S／N)為3時，角鯊烯的檢出限為11 ng／kg。

2.5 精密度試驗(yàn)

對牡丹花蕊和牡丹花粉樣品重復(fù)測定6 次，結(jié)果見表1。由表1可知，牡丹花蕊和牡丹花粉中角鯊烯測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%，5.3%，說明該方法具有良好的精密度。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收試驗(yàn)

在牡丹花蕊和牡丹花粉樣品中，分別添加1.00，2.00，3.00 g／kg的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，前處理方法同1.4，測定后計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見，回收率在92.5%～102.6%之間，說明該方法的加標(biāo)回收率滿足方法學(xué)要求，適合角鯊烯含量的測定。

2.7 樣品測定

實(shí)驗(yàn)中選取了油用牡丹花蕊和花粉作為樣品，按照實(shí)驗(yàn)方法測定了其中的角鯊烯含量，結(jié)果見表1，其平均值分別為2.73，1.75 g／kg，此結(jié)果表明：牡丹花蕊和花粉中含有大量的角鯊烯，其含量要遠(yuǎn)高于一般植物油如花生油、大豆油、亞麻籽油、葵花籽油等。

3 結(jié)論

采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定牡丹花蕊和花粉中功能性成分角鯊烯的含量。結(jié)果表明，此方法重現(xiàn)性好，靈敏度高，峰型尖銳且干擾峰少，目標(biāo)峰分離效果好，定量準(zhǔn)確。牡丹花蕊和花粉中的角鯊烯含量很高，這對開發(fā)其藥用和食用價(jià)值、指導(dǎo)牡丹產(chǎn)業(yè)的深加工、深度挖掘油用牡丹的應(yīng)用價(jià)值、促進(jìn)油用牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和提高資源利用率有一定的意義。關(guān)于牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量的測定國內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)報(bào)道，因此本課題的研究對以后角鯊烯的研究有一定的指導(dǎo)意義。

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Determination of Squalene in Peony Stamen and Pollen for Oil by Gas Chromatograph-Mass Spectrometry

Liu Yanping， Yu Hui， Ma Wenping， Wang Luxia， Li Jianxin
(Heze Institute of Product Inspection and Testing， Food Inspection Center， Heze 274000， China)

A method for quantitative of squalene in peony stamen and pollen for oil was determined by GC-MS. The peony stamen and pollen oil was extracted by Soxhlet extraction. The extracted oil samples were saponified with potassium hydroxide-ethanol solution，extracted with petroleum ether and dissolved withn-hexane. The extracted solutions were separated on a HP-5MS column and determined with mass spectrometer. The squalene content in oil peony stamen and pollen were 2.73 and 1.75 g／kg. The contents of squalene had good linear relationship in the range of 0.08-400 mg／L with the peak area of quantitative ionm／z69，and the correlation coefficient reached 0.999 6. The method of detection limit was 11 ng／kg. The recoveries of squalene ranged from 92.5% to 102.6% at fortification levels of 1.00-3.00 g／kg，and the relative standard deviation was 3.4%-5.3%(n=6). This method has good accuracy and repeatability which can be applied to the determination of squalene in oil plants and vegetable oil.

peony for oil; peony stamen; peony pollen; squalene; gas chromatograph-mass spectrometry

O657.63

：A

：1008-6145(2015)06-0052-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.06.013

聯(lián)系人：劉延平；E-mail: 2005013004@163.com

2015-07-08