馬小杰

(臨沂市環(huán)境監(jiān)測站，山東臨沂 276001)

大體積全自動固相萃取氣相色譜-質(zhì)譜法測定水中苯并芘

馬小杰

(臨沂市環(huán)境監(jiān)測站，山東臨沂 276001)

建立了全自動固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定水中苯并芘的方法。優(yōu)化了全自動固相萃取條件，選擇C8固相萃取柱萃取水樣品中的苯并芘，樣品中加入甲醇以增強苯并芘在萃取柱上的保留能力，采用正壓大體積六通道同時進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 000 mL，進(jìn)樣流量20 mL／min，使用二氯甲烷為洗脫溶劑，濃縮至0.5 mL。水中苯并芘的質(zhì)量濃度在10～200 μg／L范圍內(nèi)與其質(zhì)譜響應(yīng)值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.995，檢出限為2 ng／L。在20～200 μg／L加標(biāo)水平上，苯并芘回收率為85.0%～94.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6% (n=6)。該方法操作簡單、測定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于水中苯并芘的測定。

全自動固相萃?。粴庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用；苯并芘；正壓大體積

苯并芘是由5個苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳烴，它可損傷DNA，造成細(xì)胞癌變，對內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷［1-7］。通過實驗發(fā)現(xiàn)，苯并芘對兒童危害嚴(yán)重［8］，且可通過母體對胎兒產(chǎn)生影響［9］，已引起世界各國衛(wèi)生組織和環(huán)境組織的高度重視。環(huán)境中的苯并芘存在于煤炭、石油、煤焦油等不完全燃燒的產(chǎn)物中，并隨降雨進(jìn)入地表水，此外焦化、煉油工業(yè)廢水中也可能含有苯并芘［10-11］。我國在地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［12］和污水的排放標(biāo)準(zhǔn)［13］中對苯并芘做了嚴(yán)格限制，其限值分別為2.8 ng／L和3 ng／L。

苯并芘的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法、熒光分光光度法等［14-17］。熒光分光光度法靈敏度較高，但需要紙層析，步驟煩瑣，對于復(fù)雜樣品分離效果較差。液相色譜法和氣相色譜法依靠保留時間定性，可能會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。色質(zhì)聯(lián)用可獲得到化合物的結(jié)構(gòu)信息，定性分析結(jié)果較為可靠。由于苯并芘的水溶性較低，需要取大量水樣行富集、濃縮，以獲得較低的檢測下限。苯并芘的提取方法目前主要有液液萃取法和固相萃取法［18-20］。液液萃取法使用大量有機溶劑，操作繁瑣，且容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；而固相萃取技術(shù)不僅節(jié)約時間，不易乳化，且減少了有機溶劑對實驗人員的傷害和環(huán)境的污染［21］。固相萃取又分為手工法和全自動儀器法。手工固相萃取很難控制樣品和洗脫溶劑通過固相萃取柱的速度，致使回收率的重現(xiàn)性差，全自動固相萃取儀可自動完成活化、上樣、淋洗、洗脫、收集等步驟。筆者使用正壓大體積六通道固相萃取儀處理水樣，上樣速度快，可同時處理6個樣品，使用氣相色譜質(zhì)譜儀對水中目標(biāo)化合物定性和定量，避免了液相色譜法使用溶劑轉(zhuǎn)換以及不能準(zhǔn)確定性的缺點［22］。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜儀：Thermo Trace DSQⅡ型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

進(jìn) 樣 器：Triplus HS型，美 國Thermo Fisher Scientific公司；

全自動固相萃取儀：Dionex Auto Trace-280型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

固相萃取柱：PROELUT C8(500 mg／6 mL)，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心；

固相萃取柱：PROELUT C18(500 mg／6 mL)，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心；

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇：農(nóng)殘級，美國TEDIA公司；

無水硫酸鈉：優(yōu)級純，使用前于400℃下加熱6 h，上海國藥集團；

甲醇中苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg ／mL，美國Accu Standard公司；

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Agilent公司)；進(jìn)樣口溫度：280℃；傳輸線溫度：270℃；不分流進(jìn)樣；載氣：99.999%高純氦氣，流量為1.0 mL／min；升溫程序：初始溫度80℃保持2 min，以12℃／min升溫至270℃，保持10 min；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

EI 源；離子源溫度：250℃；電子能量：70 eV；定性方式：全掃描，質(zhì)量范圍為m／z35～450；定量方式：選擇離子檢測，定量離子為m／z252。

1.3 樣品保存與處理

使用棕色玻璃瓶采集樣品，水樣充滿樣品瓶。對于含余氯的樣品，加入硫代硫酸鈉(每1 000 mL水樣加80 mg)，在不大于4℃條件下冷藏避光保存。在進(jìn)行固相萃取操作前加入0.5%甲醇。

分別用5 mL乙酸乙酯、5 mL二氯甲烷預(yù)洗萃取柱(去除填料中的干擾物)，用10 mL甲醇、10 mL水活化萃取柱(使樣品與填料表面更好地接觸)，以20 mL／min的流速使1 000 mL樣品通過萃取柱，以10 mL水淋洗柱子(去除水溶性雜質(zhì))，氮氣干燥萃取柱10 min，5 mL二氯甲烷洗脫，洗脫時空氣注射流量為5 mL／min，收集洗脫液。洗脫液使用無水硫酸鈉干燥，氮吹濃縮至0.5 mL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將100 μg／mL的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制成1 μg／mL的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，將中間溶液稀釋為10，20，50，100，200 μg／L標(biāo)準(zhǔn)使用液，用二氯甲烷定容。在選擇離子掃描模式下，依次從低濃度到高濃度測定，以定量離子m／z252響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，苯并芘質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

根據(jù)苯并芘的結(jié)構(gòu)特點，試驗選擇弱極性的DB-5MS柱。采用不分流進(jìn)樣模式，可降低方法檢出限。苯并芘沸點較高，適當(dāng)提高進(jìn)樣口溫度有利于化合物的汽化，設(shè)置進(jìn)樣口溫度為280℃。按1.2.1的色譜條件進(jìn)行全掃描，確定苯并芘的保留時間，選取其特征離子掃描，提高分析靈敏度。圖1為苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖，圖2為苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖。

圖1 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

圖2 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

試驗選擇C8和C18兩種固相萃取小柱，對添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的水樣(100 ng／L)進(jìn)行前處理，其它條件不變，使用氣相色譜質(zhì)譜儀測定并計算回收率。結(jié)果表明，使用C18填料時苯并芘的回收率為81%，而使用C8填料時回收率在87%左右，故實驗選用C8柱。

C8和C18是疏水性最強的硅膠基體吸附劑，對非極性化合物都有較強的保留能力，使用較為廣泛。苯并芘為弱極性物質(zhì)，故選擇適合非極性到中等極性物質(zhì)萃取的C8和C18小柱，C18對極性弱的物質(zhì)的保留能力強，而C8的碳鏈較短，保留能力相對弱，目標(biāo)化合物更易洗脫。

2.2.2 進(jìn)樣流量的選擇

進(jìn)樣流量分別設(shè)為10，20，30，40 mL／min，其它條件不變，使用氣相色譜質(zhì)譜儀測定并計算回收率。圖3為進(jìn)樣流量與回收率的關(guān)系。進(jìn)樣流量為10 mL／min和20 mL／min時回收率差別不大；進(jìn)樣流量為30 mL／min和40 mL／min時回收率明顯下降，說明過快的進(jìn)樣流量，會降低目標(biāo)化合物在固相萃取柱上的吸附率，同時為減少樣品處理時間，綜合考慮采用進(jìn)樣流量為20 mL／min。

圖3 進(jìn)樣流量與回收率的關(guān)系

2.2.3 有機改性劑的影響

大量的水樣進(jìn)入固相萃取柱，會破壞柱填料的吸附條件，通常在水樣中添加有機改性劑來增加化合物在小柱上的保留能力，以提高回收率。在苯并芘質(zhì)量濃度為50 ng/L的2份水樣中分別添加5%的甲醇和5%的異丙醇，按1.2和1.3條件進(jìn)行處理和分析，試驗發(fā)現(xiàn)，添加5%的甲醇和5%的異丙醇時樣品中苯并芘的回收率分別為87%和83%，說明有機改性劑甲醇優(yōu)于異丙醇。

2.2.4 洗脫溶劑選擇

選擇二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯為洗脫溶劑進(jìn)行試驗，其它處理條件不變，對填加標(biāo)準(zhǔn)溶液的水樣(100 ng／L)進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用儀測定，并計算回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，二氯甲烷為洗脫劑時回收率最高，這是因為乙腈對苯并芘的溶解能力差，且在反相柱的洗脫能力差，而二氯甲烷極性較小，適合洗脫弱極性的化合物苯并芘，乙酸乙酯極性中等，故洗脫效果介于兩者之間。

表1 洗脫溶劑對苯并芘回收率的影響

2.3 校準(zhǔn)曲線與檢出限

按1.2色譜條件對苯并芘系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定。結(jié)果表明，苯并芘質(zhì)量濃度(x)在10～200 μg／L范圍內(nèi)與響應(yīng)值(y)線性關(guān)系良好，線性方程為y=138 584x+23 156，相關(guān)系數(shù)r=0.995。以3倍信噪比計算檢出限，結(jié)果為2 ng／L。

2.4 方法的精密度和加標(biāo)回收試驗

在沂河水樣中分別加入苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為20，100，200 ng／L，對每個質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品按優(yōu)化后的分析條件測定6次，結(jié)果見表2。由表2可知，方法回收率為85.0%～94.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%，表明方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

表2 回收率與精密度試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

通過對固相萃取柱種類、洗脫溶劑、上樣流量等的考察，建立了大體積全自動固相萃氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定水中苯并芘的方法。采用全自動正壓型固相萃取儀，可避免負(fù)壓型固相萃取裝置難以控制上樣流速的缺點，提高了分析精密度。一批樣品萃取完成后，可調(diào)用清洗程序清洗樣品流路，減少交叉污染。該方法前處理簡單快速，可同時處理6個樣品，節(jié)省了時間和人力，精密度、準(zhǔn)確度符合定量要求，適合地表水和地下水中苯并芘的分析。

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賽默飛質(zhì)譜助您辨別真羊肉、定量肉類摻假比例

賽默飛世爾科技（以下簡稱賽默飛）近日發(fā)布了基于全方位質(zhì)譜平臺的肉類檢測解決方案，建立了從摻假發(fā)現(xiàn)到定量多肽選擇，以及定量實現(xiàn)的完整流程，并對發(fā)現(xiàn)的部分多肽進(jìn)行了摻假實驗與定量能力考察。

目前最常用的肉類檢測方法：基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）和基于抗體抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫法（ELISA）。前者受到DNA降解，復(fù)雜基質(zhì)的干擾和樣品提取與擴增方法的影響，會對定性和定量的準(zhǔn)確性造成干擾；后者往往受制于抗體制備，加工過程中蛋白變性，復(fù)雜基質(zhì)和近親緣種屬之間同源干擾導(dǎo)致的假陽性影響。

隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模定性和定量研究蛋白表達(dá)譜的技術(shù)已經(jīng)成熟。因此利用質(zhì)譜技術(shù)尋找不同肉類樣品特征性蛋白或者多肽，并進(jìn)行定量，能夠避免現(xiàn)在常用的PCR技術(shù)和ELISA所面臨的種種問題，質(zhì)譜技術(shù)不受食品加工的過程影響，因為氨基酸序列比核酸序列在加工過程中更容易保存；同時實現(xiàn)定性與定量，避免假陽性且定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；能夠同時監(jiān)測多種摻假。

賽默飛基于Thermo ScientificTM超高分辨Q Exactive質(zhì)譜平臺，研究了5種常見肉類彼此之間的特征性專屬多肽, 各自找到了數(shù)百條相對于其它4個物種的特征性多肽。選取其中找到的部分多肽，通過人為將幾種不同的肉類進(jìn)行混合研究，模擬現(xiàn)實中摻假的情況，通過利用Thermo ScientificTM TSQ QuantivaTM三重四極桿質(zhì)譜儀建立了基于SRM（Selected Reaction Monitoring）的摻假比例定量方法。

基于實驗結(jié)果，對于每一個物種，為避免假陰性的結(jié)果，賽默飛研究人員同時選取雞和鴨的6條特征性多肽，分別對兩種禽類肉摻假進(jìn)行了監(jiān)測，并確定了最低的摻假檢測限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了實際檢測的需求。

與傳統(tǒng)基于PCR和抗體的檢測方法相比，質(zhì)譜具有大致相當(dāng)?shù)撵`敏度，擁有更好的避免假陰性與假陽性結(jié)果的能力，且能夠避免由于加工所帶來的PCR或者抗體相關(guān)空間結(jié)構(gòu)破壞所帶來的影響。

與上述摻假相比，還有一種相對而言更為嚴(yán)重、性質(zhì)更惡劣的摻假——病死肉的摻假?；谏鲜龇椒?，通過進(jìn)一步系統(tǒng)研究，質(zhì)譜也能夠成為一種監(jiān)測病死肉的手段，斬斷病死肉流上餐桌的魔爪，與全方位的農(nóng)殘篩查與檢測手段一起，為食品安全提供全方位的保障。同時，利用該研究方法還能幫助有機肉類產(chǎn)品生產(chǎn)商，提供肉類良種選擇依據(jù)及肉類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的可行性等。

（ 中國分析計量網(wǎng)）

Determination of Benzoapyrene in Water by Large Volume Automatic Solid Phase Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Ma Xiaojie
(Linyi Environmental and Monitoring Station， Linyi 276001， China)

A method for determination of benzoapyrene in water was established by using fully automatic solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry. Automatic solid phase extraction conditions were optimized. Benzoapyrene in water samples was extracted with C8solid-phase extraction cartridges by adding methanol to enhance benzopyrene retention capacity on solid phase extraction column. The positive pressure big volume six channel sampling at the same time was selected, the sample volume was 1 000 mL with the flow rate of 20 mL／min. Dichloromethane was used as elute solvent which was concentrated to 0.5 mL at last. The result showed that the concentration of benzopyrene in water was linear with its mass response value in the range of 10-200 μg／L，with correlation coefficient of 0.995. The detection limit was 2 ng／L. The relative standard deviation of determination results was less than 6%(n=6). The recovery rate ranged from 85% to 94.5% in the 20-200 μg／L standard addition level. The method is simple，accurate，and it is suitable for the determination of benzopyrene in water.

automatic solid phase extraction; gas chromatography-mass spectrometry; benzopyrene; positive pressure big volume

O657.7

：A

：1008-6145(2015)04-0040-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.04.012

聯(lián)系人：馬小杰；E-mail: xiaojiema@126.com

2015-05-06