韋 薇，李秋云，唐 瑋，蔣 奕，姬逸男，楊華偉，劉劍侖

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，南寧 530021)

BRCA1基因在散發(fā)性乳腺癌中的表達(dá)及異常甲基化

韋 薇，李秋云，唐 瑋，蔣 奕，姬逸男，楊華偉，劉劍侖△

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，南寧 530021)

目的 通過檢測(cè)乳腺癌易感基因1(BRCA1)基因在散發(fā)性乳腺癌中的表達(dá)情況及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，探討B(tài)RCA1基因與散發(fā)性乳腺癌的關(guān)系。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法和免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)BRCA1 mRNA和蛋白在60例散發(fā)性乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織及30例乳腺良性病變組織中的表達(dá)情況；應(yīng)用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR(BPS)聯(lián)合TA克隆測(cè)序方法檢測(cè)上述組織中BRCA1啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，分析BRCA1基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化相關(guān)性。結(jié)果BRCA1 mRNA和蛋白在散發(fā)性乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平分別低于癌旁正常組織及乳腺良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。乳腺癌組織中BRCA1蛋白的表達(dá)率為51.7%(31/60)，明顯低于癌旁正常乳腺組織的71.7%(43/60)及乳腺良性病變組織的66.7%(20/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；散發(fā)性乳腺癌組織中BRCA1啟動(dòng)子甲基化率為31.7%(19/60)，癌旁正常乳腺組織及乳腺良性病變組織均未檢測(cè)出甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；BRCA1蛋白表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.345，P=0.007)。結(jié)論乳腺癌易感基因BRCA1啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化導(dǎo)致BRCA1基因表達(dá)顯著下調(diào)，可能參與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

乳腺腫瘤；BRCA1；基因；甲基化

乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是最早發(fā)現(xiàn)的與家族遺傳性乳腺癌發(fā)生關(guān)系密切的抑癌基因[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，大約45%的家族性乳腺癌和90%的遺傳性乳腺癌中可以檢測(cè)出BRCA1基因的突變[2-3]。而在散發(fā)性乳腺癌中很少發(fā)現(xiàn)BRCA1的突變。但約有30%～40%的散發(fā)性乳腺癌中BRCA1 mRNA和蛋白表達(dá)降低或缺失[4]，表明BRCA1也是參與散發(fā)性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要基因。目前，BRCA1在散發(fā)性乳腺癌中的具體功能和作用機(jī)制尚不清楚，本研究擬從BRCA1基因表達(dá)和甲基化2個(gè)方面研究散發(fā)性乳腺癌與BRCA1基因的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科2010年9月至2012年12月乳腺手術(shù)切除標(biāo)本，包括60例散發(fā)性乳腺癌組織及配對(duì)的距癌組織陰性切緣5 cm以上的正常乳腺組織。乳腺良性病變30例，其中，乳腺纖維瘤20例，乳腺囊性增生癥10例，患者均為女性。乳腺癌患者年齡31～76歲，平均50.3歲。乳腺良性病變患者年齡18～42歲，中位年齡31歲。所有患者均無乳腺癌家族史，術(shù)前未接受化療、放療和其他抗腫瘤治療。術(shù)后所有標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師確診。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2標(biāo)本處理 術(shù)中取材后一部分標(biāo)本予生理鹽水沖洗后立即放入液氮中，然后置于-80 ℃冰箱中凍存。另一部分標(biāo)本予中性甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋保存。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LOX mRNA Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列：BRCA1 Forward:TGT GAG GCA CCT GTG GTG AC，Reverse:GTG GCT GGC TGC AGT CAG TAG(125 bp)；β-actin Forward：AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G，Reverse：CAC CTT CAC CGT TCC AGT TTT(148 bp)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按Quant SYBR Green PCR試劑盒說明書操作，實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。讀取Ct值，按公式“△CT=CT平均值(BRCA1)-CT平均值(β-actin)”分別計(jì)算各組的△CT，用2-△CT代表BRCA1 mRNA的表達(dá)量。

1.4免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋組織，以5 μm連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)染色SP法操作步驟按說明書進(jìn)行。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。BRCA1染色以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，無著色為陰性細(xì)胞。每批染色的陽性對(duì)照片應(yīng)顯示為陽性、陰性對(duì)照片應(yīng)顯示為陰性，否則整批切片重染。

1.5免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析 (1)定性分析：每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)200倍鏡視野。計(jì)算陽性細(xì)胞率=(陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù))×100%。以陽性細(xì)胞大于或等于10%為陽性，小于10%為陰性[5]。(2)定量分析：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)得每個(gè)視野陽性表達(dá)區(qū)域面積(area SUM)和累計(jì)光密度(IOD SUM)值，通過IOD SUM/area SUM計(jì)算平均光密度(IOD AVE)，取5個(gè)視野光密度平均值代表該切片BRCA1蛋白的表達(dá)量。

1.6重亞硫酸鹽測(cè)序PCR(BSP)檢測(cè)BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 應(yīng)用ABI公司的Methyl Primer Express v1.0軟件對(duì)BRCA1 mRNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2 000 bp和下游+1 000 bp進(jìn)行CpG島分析，發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)CpG島，分別為長(zhǎng)度244 bp(-1 279 bp～-1 036 bp)和長(zhǎng)度221 bp (-937 bp～-717 bp)，以-937 bp～-717 bp為檢測(cè)目標(biāo)，測(cè)序分析甲基化情況。采用Methprimer針對(duì)CpG 島設(shè)計(jì)BSP引物，引物序列如下。上游引物:5′-GAT TGG GTG GTT AAT TTA GAG T-3′；下游引物：5′-AAT TAT CTA AAA AAC CCC ACA A-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為234 bp。按DNA提取試劑盒說明書提取乳腺癌、癌旁乳腺組織及乳腺良性腫瘤組織中的DNA，用Invitrogen的MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行處理。BSP總反應(yīng)體系為25 μL，其中，上、下游引物各為0.5 μL，甲基化修飾后的DNA為1.0 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35個(gè)周期后，最后72 ℃延伸5 min結(jié)束。產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收純化，與TA載體鏈接，轉(zhuǎn)化至DH5A感受態(tài)細(xì)胞后，挑選5個(gè)陽性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用BiQ Analyzer軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1乳腺組織中BRCA1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織及乳腺良性病變組織中BRCA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平為(0.14±0.06)、(0.31±0.12)和(0.29±0.09)，BRCA1 mRNA在散發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織及乳腺良性病變組織(P<0.05)，而乳腺良性病變組織與癌旁組織間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2乳腺組織中BRCA1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) BRCA1蛋白主要分布在細(xì)胞核，少數(shù)出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)(圖1)。60例乳腺癌組織中BRCA1蛋白的表達(dá)率為51.7%(31/60)，明顯低于癌旁正常乳腺組織的71.7%(43/60)及乳腺良性病變組織的66.7%(20/30)。根據(jù)Image Pro Plus6.0軟件測(cè)得，BRCA1蛋白在乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性病變組織中的平均光密度值分別為(0.237±0.084)、(0.762±0.255)和(0.684±0.272)。乳腺癌組織中BRCA1蛋白表達(dá)率及表達(dá)量明顯低于癌旁正乳腺組織及乳腺良性病變組織(P<0.05)，后兩者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:BRCA1陽性表達(dá);B:BRCA1陰性表達(dá)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)BRCA1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況(SP，×400)

2.3乳腺組織中BRCA1甲基化的檢測(cè) 對(duì)乳腺癌和癌旁正常組織及乳腺良性病變組織中的BRCA1基因5′調(diào)控序列-937 bp～-717 bp區(qū)段內(nèi)的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的BSP測(cè)序分析，結(jié)果顯示乳腺癌組織中BRCA1啟動(dòng)子甲基化率為31.7%(19/60)，而在癌旁正常乳腺組織及乳腺良性病變組織均未檢測(cè)出BRAC1啟動(dòng)子甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。見圖2。

●：發(fā)生甲基化的CG位點(diǎn)；○：未發(fā)生甲基化的CG位點(diǎn)。

圖2 BSP方法檢測(cè)3種乳腺組織中BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化黑白點(diǎn)圖

2.4乳腺癌組織中BRCA1蛋白表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化相關(guān)性 60例乳腺癌組織中有31例BRCA1蛋白陽性表達(dá)，其中啟動(dòng)子甲基化的為5例，而29例BRCA1陰性表達(dá)的乳腺癌組織中BRCA1基因的甲基化的為14例。用Spearman相關(guān)分析，BRCA1蛋白表達(dá)與甲基化之間為負(fù)相關(guān)(r=-0.345，P=0.007)，證明BRCA1基因啟動(dòng)子的甲基化與其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

與其他腫瘤抑制基因一樣，BRCA1參與了許多重要的細(xì)胞進(jìn)程，它能防止細(xì)胞失去控制地生長(zhǎng)和分化，在調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡及轉(zhuǎn)錄活化和抑制多種生物學(xué)途徑中發(fā)揮重要作用[6-7]。BRCA1功能的缺陷，可能會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，從而增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8]。BRCA1基因突變?cè)诩易逍匀橄侔┲械淖饔靡训玫綇V泛認(rèn)同，而在散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因的突變非常罕見，但有研究發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性乳腺癌中BRCA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的下降或缺失。這些結(jié)果表明，有突變之外的其他機(jī)制參與了散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因在轉(zhuǎn)錄水平和(或)轉(zhuǎn)錄后水平的抑制。

近年來研究發(fā)現(xiàn)DNA啟動(dòng)子甲基化模式的改變，尤其是某些抑癌基因局部甲基化水平的異常增高，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過程中起到了不容忽視的作用[9]。啟動(dòng)子異常甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，主要發(fā)生在啟動(dòng)子CpG島內(nèi)5′-端胞嘧啶堿基上，這些位點(diǎn)在正常情況下處于未甲基化狀態(tài)。發(fā)生異常甲基化往往會(huì)改變基因的表達(dá)模式，導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制或沉默，失活的抑癌基因不能負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性改變[10]。P16、NOEY2、TIMP3、RASSF1A等基因是目前已經(jīng)得到證實(shí)的發(fā)生DNA甲基化的乳腺癌相關(guān)基因[11-13]。

乳腺癌易感基因BRCA1啟動(dòng)子甲基化近年來在散發(fā)性乳腺癌中也受到廣泛關(guān)注。Rice等[14]檢測(cè)6個(gè)散發(fā)性乳腺癌細(xì)胞系的BRCA1啟動(dòng)子的甲基化水平及mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)細(xì)胞系的BRCA1的CpG位點(diǎn)60%以上發(fā)生甲基化，其mRNA表達(dá)水平僅為正常乳腺上皮細(xì)胞水平的1/8。其他5個(gè)細(xì)胞系的BRCA1 mRNA表達(dá)也有不同程度的下降，但均未檢測(cè)到甲基化。說明BRCA1 mRNA的表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)生有關(guān)，mRNA表達(dá)水平可能受啟動(dòng)子甲基化水平調(diào)控。本研究檢測(cè)了60例散發(fā)性乳腺癌組織、與之配對(duì)癌旁組織以及30例乳腺良性病變組織中BRCA1基因表達(dá)水平及啟動(dòng)子甲基化情況。結(jié)果顯示BRCA1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織及乳腺良性病變組織。這表明乳腺癌中BRCA1基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了下調(diào)。根據(jù)亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果顯示BRCA1啟動(dòng)子在部分乳腺癌組織中發(fā)生了甲基化，而癌旁正常乳腺組織和乳腺良性病變組織中均未發(fā)生甲基化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中BRCA1蛋白的表達(dá)與其啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)。發(fā)生啟動(dòng)子甲基化的BRCA1蛋白在乳腺癌組織中多為陰性表達(dá)，而未發(fā)生啟動(dòng)子甲基化的BRCA1蛋白多呈陽性表達(dá)。因此，推測(cè)在散發(fā)性乳腺癌中，BRCA1基因啟動(dòng)子的甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)顯著下調(diào)的主要機(jī)制。

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Expression and abnormal methylation BRCA1 in sporadic breast cancer*

WeiWei，LiQiuyun，TangWei，JiangYi，JiYinan，YangHuawei，LiuJianlun△

(DepartmentofBreastSurgery，CancerHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To investigate expression and promoter methylation status of BRCA1 in sporadic breast cancer.Methods The expression of BRCA1 mRNA and protein were detected in 60 cases of sporadic breast cancer，the adjacent breast tissues，and 30 cases of breast benign lesion tissue by RT-PCR and and immunohistochemical staining respectively.The methylation status of BRCA1 promoter in those tissues were detected using bisulfite genomic sequencing PCR (BSP) combined with TA clone for sequencing．The relation between BRCA1 expression in sporadic breast cancer and promoter methylation status was analyzed.Results The expression level of BRCA1 mRNA and protein were down-regulated in sporadic breast cancer tissues compared to the corresponding adjacent breast tissues and breast benign lesion tissue(P<0.001).The positive rates of BRCA1 protein was 51.7%(31/60)in sporadic breast tissue，which were significantly lower than those of in the adjacent breast tissues 71.7%(43/60)and breast benign lesion tissue 66.7%(20/30)(P<0.001).The methylation rate of BRCA1 promoter CpG was 31.7%(19/60)in sporadic breast，while it wasn′t found in adjacent breast tissues and breast benign lesion tissue(P=0.000).The statistical analysis showed the expression of BRCA1 had significant negative correlation with promoter methylation(r=-0.345，P=0.007).Conclusion The hypermethylation of BRCA1 promoter could induce BRCA1 down-regulating，which may be involved in the occurrence and development of sporadic breast cancer.

breast neoplasms;BRCA1;gene;methylation

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.09.007

廣西自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(2011GXNSFB018102)。

韋薇(1978-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事乳腺癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者，Tel：(0771)5308635；E-mail:gxzlwxwk@126.com。

R730.2

A

1671-8348(2015)09-1174-03

2014-10-08

2014-12-15)