高 涵，周 濤，張春晶，李淑艷，王麗萍，劉哲丞

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)院第一附屬醫(yī)院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161006)

細(xì)胞周期調(diào)控因子P16INK4、P57kip2和Ki67在肝癌中的表達(dá)及意義

高 涵1，周 濤2△，張春晶1，李淑艷1，王麗萍1，劉哲丞1

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)院第一附屬醫(yī)院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161006)

目的 探討細(xì)胞周期調(diào)控因子P16INK4、P57kip2和Ki67在肝癌中的表達(dá)水平及其意義。方法收集正常肝組織標(biāo)本21例，肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本48例及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本48例為研究對(duì)象，通過免疫組織化學(xué)和Western blot分析P16INK4、P57kip2和Ki67的表達(dá)水平。結(jié)果P16INK4及P57kip2蛋白肝癌組織中的表達(dá)與癌旁組織及正常肝臟組織比較顯著降低，陽性率分別為49.3%和34.2%，Ki67蛋白肝癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，其陽性率為91.7%，與癌旁組織及正常肝臟組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果與Western blot 結(jié)果一致；高、低分化組P57kip2、Ki67及P16INK4的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)16INK4、P57kip2表達(dá)降低及Ki67的高表達(dá)在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能有重要的作用。

P16INK4；P57kip2；Ki67；肝癌

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellcular carcinoma，HCC)是目前中國最常見的腫瘤之一，其惡性程度高，居中國癌癥死因的第2位。腫瘤基因水平的不斷探索發(fā)現(xiàn)腫瘤是多基因變化引起細(xì)胞周期紊亂從而導(dǎo)致細(xì)胞生長失控的一類疾病[1]。P16INK4基因是人類腫瘤中最常見的抑癌基因之一，其翻譯產(chǎn)物通過抑制細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶(CDK4/6)參與細(xì)胞周期調(diào)控，抑制細(xì)胞的增殖和分化[2]。P57kip2是新發(fā)現(xiàn)的廣譜CDK抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)P57kip2的失活與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可以作為腫瘤預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)[3]，而Ki67作為反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的標(biāo)記物，常用于即時(shí)反映腫瘤增殖細(xì)胞的數(shù)量，判斷腫瘤的惡性程度[4]。本研究通過觀察P16INK4、P57kip2及Ki67在肝癌中的表達(dá)水平，探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究收集2010年7月至2014年7月在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除、肝臟穿刺及尸體解剖標(biāo)本，其中，正常肝組織標(biāo)本21例，肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本48例，根據(jù)Edmondson分級(jí)法[5]分為一級(jí)6例，二級(jí)23例，三級(jí)12例，四級(jí)7例；與肝癌組織對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本48例。以上標(biāo)本由本校病理中心專業(yè)人員確認(rèn)。

1.2主要儀器與試劑 LEICA RM2165切片機(jī)、JLT-A型包埋專用冷臺(tái)、YT-7F烤片機(jī)、Olympus全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)、OLYMPUS顯微鏡、UVP凝膠成像系統(tǒng)、羊抗人多克隆抗體P57kip2、鼠抗人單克隆抗體Ki67、鼠抗人單克隆抗體P16INK4、SP-900免疫組織化學(xué)染色試劑盒、Bradford蛋白測(cè)定試劑。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色 組織塊經(jīng)10%甲醛溶液固定后，采用常規(guī)石蠟包埋切片，采用通用型二步法免疫組織化學(xué)染色方法，經(jīng)檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)，分別檢測(cè)肝癌組織、癌旁組織及正常肝癌組織中P57kip2、Ki67及P16INK4的表達(dá)水平。每批染色均采用PBS液替代一抗為陰性對(duì)照，采用已知切片做陽性對(duì)照。結(jié)果判定組織中P57kip2、Ki67及P16INK4免疫陽性物質(zhì)定位于胞漿，胞漿凡出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，在每個(gè)切片上下左右及中間隨機(jī)選取高倍視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算總細(xì)胞數(shù)不少于1 000個(gè)。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞大于或等于10%為陽性、小于10%為陰性。

1.3.2蛋白樣品制備 從-80 ℃冰箱取出收集肝癌、癌旁組織及正常肝黏膜組織，稱取0.2 g組織加200 μL組織裂解液(50 mmol/mL Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/mL PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑)冰浴勻漿。將勻漿液4 ℃以12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15%聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗(P57kip2、Ki67及P16INK4)，37 ℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X光膠片定影，掃描后用IPP6.0進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1P57kip2、Ki67及P16INK4在各組肝組織中的表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示P57kip2蛋白在肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織中陽性率分別為34.2%、57.1%及72.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A～C；Ki67蛋白在肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織中陽性率分別為91.7%、84.9%及6.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1D～F；P16INK4在肝癌組織、癌旁組織及正常肝癌組織中的陽性率分別為49.3%、68.1%及98.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1G～I(xiàn)，與Western blot結(jié)果一致，見圖2。

圖1 肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織中P57kip2、Ki67及P16INK4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

圖2 肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織中P57kip2、Ki67及P16INK4 Western blot結(jié)果

2.2不同分化程度肝癌中P57kip2、Ki67及P16INK4的表達(dá) 根據(jù)Edmondson分級(jí)，將一、二級(jí)作為低分化組，三、四級(jí)作為高分化組，分析結(jié)果顯示在不同分化組P57kip2、Ki67及P16INK4的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同分化程度肝癌中P57kip2、Ki67及P16INK4的表達(dá)水平比較[n(%)]

3 討 論

乙肝病毒或丙肝病毒感染導(dǎo)致肝炎、肝硬化到腺瘤樣增生結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)化為早期肝癌、晚期肝癌最終肝癌轉(zhuǎn)移的多階段發(fā)生、發(fā)展過程中抑癌基因的突變、失活及癌基因的過度表達(dá)共同促使正常的肝細(xì)胞增生、癌變[6-7]。近年研究結(jié)果顯示癌基因及抑癌基因多數(shù)作用聚集在細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制上，通過直接參與肝細(xì)胞的周期調(diào)控[8]，促使肝細(xì)胞呈現(xiàn)失控性增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

P16蛋白能通過抑制CDK4的活性使細(xì)胞分裂停滯于G1/S期阻止細(xì)胞的異常增生，是一種重要的抑癌基因，大量研究顯示在肝細(xì)胞癌組織中P16基因常出現(xiàn)表達(dá)缺失或異常，進(jìn)展期肝細(xì)胞癌組織中其異常率高達(dá)60%，被認(rèn)為是致病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[9]。P57位于染色體11p15.1，該區(qū)域的缺失常與腫瘤相關(guān)。研究顯示P57在前列腺癌、膀胱癌及胰腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低[10-12]。P57基因敲除小鼠出現(xiàn)增長過度，呈現(xiàn)高頻率的腫瘤轉(zhuǎn)向，研究主要認(rèn)為其通過抑制細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤發(fā)生[13]。有研究顯示P57在細(xì)胞核中能通過抑制cyclinD1及CDK2的表達(dá)，降低CDK4/cyclinD1及CDK2/cyclinE的活性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。Ki67被廣泛用于反映癌癥及肺癌細(xì)胞的增殖活性[15-16]。為了研究P57kip2、Ki67及P16INK4在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，本研究通過免疫組織化學(xué)染色和Western blot法分析其在肝癌組織、對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常肝癌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示p57kip2蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織及正常肝臟組織，Ki67蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，P16INK4在肝癌組織中表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P16INK4及P57kip2表達(dá)可能降低參與細(xì)胞周期G1/S調(diào)控，促使正常肝細(xì)胞的增殖發(fā)生紊亂，增長過度，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，在此過程中作為腫瘤細(xì)胞增殖的指標(biāo)之一，Ki67的表達(dá)顯著增加。根據(jù)Edmondson分級(jí)，高分化組中P57kip2、P16INK4呈現(xiàn)低表達(dá)，Ki67表達(dá)較低分化組增加，提示P57kip2、P16INK4及Ki67在肝癌的發(fā)展過程中可能有重要的作用。

P16INK4、P57kip2表達(dá)降低及Ki67的高表達(dá)在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能有著重要的作用，P16INK4、P57kip2參與的細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化異常，可能是肝癌發(fā)生的機(jī)制之一，三者聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)于肝細(xì)胞癌的診斷有重要的價(jià)值。

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Expression and significance of P16INK4,P57kip2and Ki67 in hepatocellular carcinoma*

GaoHan1,ZhouTao2△,ZhangChunjing1,LiShuyan1,WangLiping1,LiuZhecheng1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiologyofQiqiharMedicalUniversity,Qiqihar,Heilongjiang161006，China;2.GeneralSurgeryofFirstAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalUniversity,Qiqihar,Heilongjiang161006，China)

Objective Analysis the expression and significance of P16INK4,P57kip2and Ki67 in hepatocellular carcinoma.Methods 21 normal liver tissue,48 hepatocellular carcinoma tissues and 48 corresponding adjacent tissue were collected for this study.Immunohistochemical analysis the expression levels of P16INK4,P57kip2and Ki67.Results P16INK4and P57kip2in hepatocellular carcinoma tissue were significantly lower,the positive rates were 49.3% and 34.2% respectively,Ki67 was significantly higher than the normal liver tissue and corresponding adjacent tissue,the difference was statistically significant(P<0.05),the results were consistent with the Western blot;different differentiated group p57kip2,Ki67 expression and P16INK4were significant differences(P<0.05).Conclusion Low expression of P16INK4and P57kip2,the higher expression of Ki67 play an important role in the development of hepatocellular carcinoma.

P16INK4；P57kip2;Ki67；hepatocellular carcinoma

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.09.004

黑龍江省齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(SFGG-201338)。

高涵(1978-)，講師，碩士，主要從事腫瘤與分子生物學(xué)研究?！?/p>

R735.7

A

1671-8348(2015)09-1165-03

2014-10-31

2014-12-22)