（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術工程技術研究中心河北保定071000）

豬瘟活疫苗的品質提升研究

梁武1,2,何平有1,2,韓佳麗1,2,楊保收1,2，朱秀同1,2

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術工程技術研究中心河北保定071000）

為了提高豬瘟活疫苗的產品質量，本研究采用改良保護劑分別與豬瘟組織毒和豬瘟細胞毒進行凍干試驗，成功試制2種豬瘟活疫苗。試制的2種豬瘟活疫苗，性狀和溶解情況良好，室溫保存2 d和溶解后室溫放置4 h對產品效價變化不明顯，均達到規(guī)程標準要求。

豬瘟活疫苗；品質；提升

豬瘟活疫苗活疫苗按規(guī)程工藝生產產品出現溶解狀態(tài)不佳、長途運輸品質下降，我公司經過技術改良取得較好效果，現將研究結果報告如下：

1 材料

1.1 毒種

豬瘟病毒兔化弱毒株（C株）由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定并提供，瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司結合優(yōu)良的原材料生產，經全面鑒定為合格，置于-70℃保存供疫苗生產用。

1.2 實驗動物

選用營養(yǎng)良好，體重1.5～3 kg家兔。購入后，家兔應隔離飼養(yǎng)觀察30 d以上。家兔接種前，至少應測溫觀察5 d，每日上、下午各測溫1次。選用體溫正常、體溫波動小于0.5℃的家兔。

1.3 凍干保護劑

凍干脫脂乳購自新西蘭；多聚蛋白胨購自日本株式會社；蔗糖、吐溫-80等購自北京益利公司。

1.4 其他試劑與設備

MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；豬瘟抗原檢測試劑盒購自北京愛德仕公司；豬瘟專用新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司；胰蛋白酶購自Gibco公司。

2 方法

2.1 半成品制備

2.1.1 豬瘟病毒組織毒制備按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（2000年版）以下簡稱《規(guī)程》[1]要求接種健康家兔收獲脾淋組織制備半成品。

2.1.2 豬瘟細胞毒制備豬瘟細胞毒接種易感ST細胞，收獲培養(yǎng)物，制備細胞毒半成品。

2.2 保護劑的配制

2.2.1 牛奶脫脂乳保護劑配制按照《規(guī)程》附錄426頁所述方法進行配制，經121℃滅菌15 min備用。

2.2.2 改良保護劑配制[2]將蔗糖、多聚蛋白胨、吐溫-80和脫脂乳等按照一定比例配制而成，制備3批保護劑，經除菌后備用。

2.3 疫苗配制

2.3.1 組織毒疫苗的配制[1]在無菌操作下剔除脂肪組織。將檢驗合格的制苗組織稱重、剪碎，然后加入適量改良保護劑混合4～8℃恒溫研磨并控制產品粒徑在0.2 μm，濾過扣除沉渣量，再按實際組織量補足剩余保護劑，進行定量分裝凍干。并設立原工藝疫苗（《規(guī)程》）對照。

2.3.2 細胞毒疫苗的配制將檢驗合格的豬瘟病毒細胞毒病毒液混合于同一無菌容器內，按照適量比例添加改良保護劑，充分混合后進行定量分裝與凍干。并設立原工藝疫苗對照。

2.4 疫苗檢驗

2.4.1 性狀觀察凍干品是否為海綿狀疏松團塊物質性狀。

2.4.2 溶解性加入相應疫苗稀釋液測定其完全溶解的時間并觀察溶解后2 h物理狀態(tài)是否改變（不溶物或沉淀）。

2.4.3 環(huán)境因素對疫苗的影響 測定-15℃放置1年、室溫（25℃）放置2 d以及溶解后室溫放置4 h產品的效價。

2.4.4 其它檢驗按照原質量標準要求進行其余各項檢驗。

3 結果

3.1 3批疫苗的性狀和溶解情況

3.1.1 性狀結果（如圖1～2）。從圖中可以看出，豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細胞源），物理性狀良好，均為海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離。

圖1 豬瘟活疫苗（兔源）左2：改良配方組；右2：對照

圖2 豬瘟活疫苗（細胞源）左2：改良配方組；右2：對照

3.1.2 溶解情況從表1可以看出，改良保護劑組均能有效地改善豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細胞源）的溶解狀態(tài)，溶解后無沉淀或漂浮物，而對照品均有不同程度的沉淀，豬瘟活疫苗（兔源）對照品還有漂浮物。

表1 豬瘟活疫苗溶解情況比較

3.2 環(huán)境因素對產品效價的影響

從表2可以看出改良保護劑的豬瘟活疫苗（兔源）、豬瘟活疫苗（細胞源）室溫放置2 d；溶解后能在室溫放置4 h產品滴度均不下降，而對照品均有不同程度的下降。

表2 環(huán)境對豬瘟活疫苗效價的影響

3.3 其它檢驗結果（見表3）

3批豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細胞源）、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、安全檢驗、剩余水分和真空度檢驗均符合規(guī)程要求。

表3 3批活疫苗的檢測結果

4 分析與討論

4.1 產品溶解性[3]

產品的溶解性直接影響產品應用方便程度和應用效果。在長期臨床應用研究中我們發(fā)現豬瘟組織苗（脾淋苗）在使用常常出現情況：溶解速度慢常常需要幾分鐘，溶解以后出現有漂浮物和沉淀的情況。經過我們觀察，初步將漂浮物分為二類，一類是不相容的油滴，另一類為絮狀結締組織。針對油狀漂浮物，一方面采用搗碎前的脂肪組織、結締組織分離，另一方面，采用冷處理分離技術有效分離油狀物和結締組織。出現沉淀和溶解速度慢，這可能與組織顆粒大，凍干品過于致密相關，病毒提取工藝不佳，在本研究中我們一方面控制搗碎顆粒大小0.2 μm以內，另一方面采用增溶劑保證病毒顆粒充分溶出，嚴禁大顆粒濾過。而豬瘟細胞苗溶解的主要問題是有沉淀，這可能與抗原液的pH值相關，研究中經過pH調節(jié)和增溶劑等的調整，改進產品未見溶解后有沉淀。

4.2 產品的保存與使用

產品嚴格按照質量標準的要求進行保藏和使用是可以保證產品質量的。但是我們在運輸、保存和使用中，常常保存溫度略有上升達不到相關要求，造成產品質量下降。這種產品質量可能由于產品保存溫度上升，蛋白質發(fā)生凝聚、氧化反應和水解反應等[4]作用下，導致產品中病毒蛋白部分失活，從而使得產品質量下降。而這種溫度升高，經過估算相當于室溫放置1 d左右，溶解后室溫放置2 h以內。經抗氧化成分和蛋白增溶劑的添加，室溫放置2 d或室溫溶解4 h后檢測產品質量仍合格，說明該方法在外界環(huán)境作用下有一定維持產品質量的作用，一定程度上滿足了養(yǎng)殖生產的實際需要。

5 結論

本試驗成功地研制出一種凍干保護劑。應用該保護劑中試生產的3批豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細胞源），全部通過無菌、支原體、鑒別、安全、效力、剩余水分、真空度等各項檢驗，均符合《規(guī)程》要求。

中試生產的3批豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟活疫苗（細胞源）顯示出良好的性狀和溶解性能，對外界因素有一定抵抗力，室溫放置2 d或室溫溶解4 h對產品效價影響不明顯，均達到規(guī)程要求?！觯ň庉嫞黑w曉松）

[1] 中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[S],2000.

[2] 朱良全.豬瘟兔化弱毒（C株）和雞馬立克火雞皰疹病毒（HVT）病毒保護劑的研究 [D].中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學位論文, 2004(7).

[3] L.拉赫曼,H.A.利伯曼,J.L.卡尼希.工業(yè)藥劑學的理論與實踐[M].北京:化學工業(yè)出版社,1984.

[4] 華澤釗.冷凍干燥新技術[M].北京:科學出版社,2005.

Study on Improving the Quality of Live Vaccines for Swine

LiangWu1,2,He Pingyou1,2,Han Jiali1,2,Yang Baoshou1,2,Zhu Xiutong1,2
(1.Ringpu(Baoding)Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.,Baoding Hebei,071000;
2.Hebei Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biotechnology,Baoding Hebei,071000)

Applied the modified stabliliser with rabbit origin swine fever virus or tissue culture origin swine fever virus on lyophilisation tests to improving the quality of the live vaccine for swine,2 different swine fever live vaccines had been trial produced,all shape and properties and dissolution characters were passed the test. Placing these vaccine in room-temperature (RT)for 2 days,and then reconstitute it in RT for 4h,the titers were changed insignificantly and passed all procedure standards.

swine fever，live vaccine,quality,improving

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.09.038

河北省現代農業(yè)科技獎勵性后補助項目（15926617H）。

梁武（1968-），男，天津人，博士，高級獸醫(yī)師，主要從事獸用生物制品學研究工作E-mail:sales@ringpu.com。