彭麗娟 杜經(jīng)緯 徐 俊 常晉霞 胡為民 潘萬(wàn)龍.川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川南充67000；.四川省南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川南充67000；.四川省南充市中心醫(yī)院心胸外科，四川南充67000

IL-12B基因多態(tài)性及血清表達(dá)水平與食管癌的關(guān)系

彭麗娟1杜經(jīng)緯2徐 俊3常晉霞1胡為民1潘萬(wàn)龍1
1.川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川南充637000；2.四川省南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川南充637000；3.四川省南充市中心醫(yī)院心胸外科，四川南充637000

目的探討白細(xì)胞介素（IL）-12B 3′UTR+16974（A/C）位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）及其血清表達(dá)水平與食管癌的關(guān)系。方法隨機(jī)選取2013年6月～2014年6月在四川省南充市中心醫(yī)院就診的食管癌患者52例為試驗(yàn)組，術(shù)后收取患者腫瘤組織和癌旁組織，提取其基因組DNA，針對(duì)IL-12B基因3′UTR+16974（A/C）SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其中患者腫瘤組織DNA作為癌組織，癌旁3～5 cm組織DNA作為癌旁組織，分析IL-12B基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。選取同期健康體檢者40例為對(duì)照組，同時(shí)收集患者和健康體檢者血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平。結(jié)果癌組織AA、AC、CC基因型頻率分別是23.08%、15.38%、61.54%，癌旁組織AA、AC、CC基因型頻率分別是15.38%、38.46%、46.15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。癌組織A、C等位基因頻率分別為30.77%（32/104）、69.23%（72/104），癌旁組織A、C等位基因頻率分別為34.62%（36/104）、65.38%（68/104），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。試驗(yàn)組IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論IL-12B 3′UTR+16974（A/C）位點(diǎn)CC基因型可能是食管癌的易感基因型，IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平升高與食管癌發(fā)生有關(guān)。

食管癌曰白細(xì)胞介素-12曰白細(xì)胞介素-12B曰多態(tài)性曰單核苷酸

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12B是一種70 kD的糖蛋白，由相對(duì)分子質(zhì)量為35（p35）和40（p40）（分別由IL-12A基因和IL-12B基因編碼）的兩條多肽鏈組成的異二聚體。IL-12B基因16974 A/C在羧基端非翻譯區(qū)具有多態(tài)現(xiàn)象，影響IL-12的產(chǎn)生與表達(dá)，并與Th1介導(dǎo)的疾病有關(guān)，如硅沉著?。?］、Graves眼?。?］、宮頸癌［3］等。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者IL-12血清表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)［4］。本研究擬探討IL-12B基因多態(tài)性及血清表達(dá)水平與食管癌的關(guān)系，為尋找食管癌新的遺傳標(biāo)記、食管癌診斷提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年6月～2014年6月在四川省南充市中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）就診的食管癌患者52例為試驗(yàn)組，其中男36例，女16例，平均年齡（63.81± 9.07）歲，均適宜做手術(shù)，術(shù)前均未接受放、化療，術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌，無(wú)其他腫瘤病史。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第七版公布的食管癌分期為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行分期。同時(shí)選取我院同期健康體檢者40例為對(duì)照組，其中男25例，女15例，平均年齡（45.35±8.72）歲，血常規(guī)、肝腎功、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖類(lèi)抗原（CA）242、CA125指標(biāo)顯示無(wú)明顯異常。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及引物合成腫瘤組織DNA作為癌組織，癌旁組織DNA作為癌旁組織。分別收集患者術(shù)后新鮮腫瘤組織和癌旁3～5 cm組織10～20 mg，采用組織基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）快速提取DNA，-20℃保存。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)包含IL-12B 3′UTR+16974 A/C位點(diǎn)SNP上游引物5′-GATATCTTTGCTGTATTTGTATAGTT-3′，下游引物5′-AATATTTAAATAGCATGAAGGC-3′，由武漢華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 PCR反應(yīng)及測(cè)序PCR擴(kuò)增體系為25 μL，DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 2 μL，10×緩沖液2.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，無(wú)菌去離子水18.3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司，PCR反應(yīng)在BIO-RAD PTC-200 PCR儀上完成。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物送武漢華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 ELISA檢測(cè)患者術(shù)前血清作為試驗(yàn)組，健康體檢者血清作為對(duì)照組。收集相應(yīng)患者術(shù)前和健康體檢者靜脈血液標(biāo)本入凝血管，每人空腹抽血3 mL，室溫靜置凝血1～2 h，離心取血清-80℃保存。參照ELISA檢測(cè)試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）說(shuō)明進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（依s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

提取的組織基因組DNA經(jīng)PCR，擴(kuò)增出包含IL-12B 3′UTR+16974位點(diǎn)基因片段，約1024 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢華大基因科技有限公司測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)，結(jié)果與人IL-12B基因序列有99%的同一性。

2.1 IL-12B 3′UTR+16974淵A/C冤位點(diǎn)多態(tài)性3種基因型頻率分布

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，癌組織和癌旁組織3種基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；將3種基因型分別進(jìn)行比較，AA和AC基因型構(gòu)成比、AC和CC基因型構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CC基因型在癌組織中頻率明顯較癌旁組織高。見(jiàn)表1。

表1 IL-12B 3′UTR+16974（A/C）位點(diǎn)多態(tài)性3種基因型頻率分布［%（n1/n2）］

2.2 IL-12B 3′UTR+16974淵A/C冤位點(diǎn)多態(tài)性等位基因頻率分布

癌組織A等位基因和C等位基因頻率分別為30.77%（32/104）、69.23%（72/104），癌旁組織A等位基因和C等位基因頻率分別為34.62%（36/104）、65.38%（68/104），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.35，P=0.55）。

2.3 兩組IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平比較

試驗(yàn)組IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；試驗(yàn)組IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討論

IL-12主要通過(guò)Th1細(xì)胞間接發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用［5-6］。在某些疾病中可見(jiàn)IL-12 p40異常表達(dá)，如IL-12 p40在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤組織中的表達(dá)量均明顯高于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織及反應(yīng)性淋巴組織增生中的表達(dá)［7］。

圖1 兩組IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平比較

近年發(fā)現(xiàn)某些疾病發(fā)生與IL-12B多態(tài)性有關(guān)。如IL-12B rs3212227基因多態(tài)性與卵巢癌的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［8］；正常孕婦IL-12B基因啟動(dòng)子區(qū)存在多態(tài)性變異，其中-671G/T和-405G/T構(gòu)成的單體型-671T/-405G可能與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的易感性有關(guān)［9］；IL-12B rs3212227基因多態(tài)性與廣西地區(qū)人群原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌有明顯關(guān)聯(lián)性［10］；IL-12B rs15677380和rs14050311基因多態(tài)性與肝硬化的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)［11］；IL-12B rs3212227多態(tài)性與原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系不密切［12］。

食管癌多態(tài)性方面僅有個(gè)別基因位點(diǎn)多態(tài)性的報(bào)道，如ERCC1基因C8092A位點(diǎn)在福建地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌患者中未見(jiàn)多態(tài)性表達(dá)［13］，食管癌患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性和ATM基因rs664143位點(diǎn)多態(tài)性與食管癌的發(fā)生有一定聯(lián)系［14-15］。本研究通過(guò)直接對(duì)腫瘤組織DNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IL-12B 3′UTR+16974位點(diǎn)CC基因型在食管癌組織中頻率明顯較癌旁組織高，提示CC基因型可能是食管癌的易感基因型，IL-12B 3′UTR+16974位點(diǎn)基因多態(tài)性與食管癌發(fā)病有關(guān)。

體外研究證實(shí)，轉(zhuǎn)染IL-12基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外增殖和對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤有明顯的抑制作用［16］；IL-12增強(qiáng)CIK細(xì)胞對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞的殺傷活性［17］；小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合IL-12重組質(zhì)粒在荷瘤小鼠體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用可獲得更強(qiáng)的抗腫瘤活性［18］。體內(nèi)研究證實(shí)，IL-12血清表達(dá)水平在腫瘤早期、組織分化程度較高、沒(méi)有轉(zhuǎn)移的情況下表達(dá)量高于晚期及組織分化程度低和發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組IL-12 p40和IL-12都異常高表達(dá)（P＜0.01），原因可能為試驗(yàn)組均是適宜做手術(shù)的患者，食管癌未處于晚期。推測(cè)其理論基礎(chǔ)可能與機(jī)體發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴有關(guān)，腫瘤發(fā)生時(shí)不斷刺激機(jī)體分泌IL-12以此來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的［20-21］。但隨著疾病惡化，免疫調(diào)節(jié)紊亂，機(jī)體抗腫瘤作用減弱，IL-12 p40和IL-12血清表達(dá)水平是否會(huì)出現(xiàn)降低，還有待進(jìn)一步研究。

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Relationship between gene polymorphisms,serum expression level of IL-12B and esophageal cancer

PENG Lijuan1DU Jingwei2XU Jun3CHANG Jinxia1HU Weimin1PAN Wanlong1
1.Department of Microbiology and Immunology,North Sichuan Medical College,Sichuan Province,Nanchong637000, China;2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Central Hospital of Nanchong City,Sichuan Province, Nanchong637000,China;3.Department of Cardiothoracic Surgery,Central Hospital of Nanchong City,Sichuan Province,Nanchong637000,China

ObjectiveTo investigate relationship between interleukin(IL)-12B gene 3′untranslating region(UTR)+16974 (A/C)single nucleotide polymorphism,serum IL-12B level and esophageal cancer.Methods52 patients with esophageal cancer treated in Nanchong Central Hospital of Sichuan Province from June 2013 to June 2014 were randomly selected as experimental group.Esophageal carcinoma tissues and para-carcinoma tissues of 52 patients were collected after operation. DNA was extracted from these tissues.The genotype of the IL-12B 3′UTR+16974(A/C)polymorphisms were determined by polymerase chain reaction and sequencing.The patients with tumor tissues DNA were used as cancer tissues,and the adjacent 3-5 cm tissues were used as para-carcinoma tissues.The correlation between IL-12B gene polymorphism and tumor occurrence was analyzed.40 cases of healthy persons were selected as control group,at the same time,the serum of patients and healthy persons were collected.The serum expression level of IL-12 p40 and IL-12 were detected by enzymelinked immunosorbent assay.ResultsThe frequency of AA,AC and CC genotype in cancer tissues was 23.08%, 15.38%and 61.54%respectively,the frequency of AA,AC and CC genotype in para-carcinoma tissues was 15.38%, 38.46%and 46.15%respectively,with statistical difference(P＜0.05).The frequency of allele A and C in cancer tissues was 30.77%(32/104)and 69.23%(72/104)respectively,the frequency of allele A and C in para-carcinoma tissues was 34.62%(36/104),65.38%(68/104)respectively,there was no significant difference(P＞0.05).The serum expression levels of IL-12 p40 and IL-12 in experimental group were significantly higher than those in control group(P＜0.01).Con鄄clusionA/C polymorphism genotype CC of IL-12B 3′UTR+16974 site may be susceptible to esophageal cancer,the elevation of serum levels of IL-12 p40 and IL-12 are related to the occurrence of esophageal cancer.

Esophageal cancer;Interleukin-12;Interleukin-12B;Polymorphisms;Single nucleotide

R392.7

A

1673-7210（2015）12（a）-0020-04

2015-08-21本文編輯：李亞聰）

四川省教育廳自然科學(xué)類(lèi)項(xiàng)目（15ZB0188）；四川省南充市科技局應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)資金項(xiàng)目（2010SF05）。

彭麗娟（1983-），女，碩士，從事醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)教學(xué)及科研工作。