王朝霞，趙 燁，范春雨，呂吉元

17β-雌二醇對H2O2致血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究

王朝霞，趙 燁，范春雨，呂吉元

目的 探討17β-雌二醇對H2O2引起的血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用和可能的機(jī)制。方法 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株在37 ℃、5%CO2，條件下正常培養(yǎng)至細(xì)胞形成致密單層時，分別進(jìn)行干預(yù)。實驗分為5組，空白對照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)，含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；過氧化氫損傷組：將培養(yǎng)融合狀態(tài)達(dá)到80%～90%的HUVEC，每孔加入終濃度為0.75 mmol/L的H2O2；H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)組：H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L；單純17β-雌二醇組：17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L；H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組 H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L，渥曼青霉素終濃度100 nmol/L。收集干預(yù)后的各組細(xì)胞，Western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt蛋白表達(dá)情況，用CCK-8法比較細(xì)胞活性，流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞凋亡率，熒光探針標(biāo)記法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果 17β-雌二醇可以明顯提高氧化應(yīng)激損傷組內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt的表達(dá)，17β-雌二醇可以明顯提高H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，降低早期和晚期凋亡率，并且減少H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，在加入PI3K/Akt通路的特異性抑制劑渥曼青霉素以后，17β-雌二醇抗氧化損傷的作用明顯減弱。結(jié)論 17β-雌二醇通過上調(diào)H2O2導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后胞內(nèi)PI3K/Akt蛋白的表達(dá)，提高細(xì)胞存活率，發(fā)揮抗氧化損傷和抗細(xì)胞凋亡作用，這可能是雌激素發(fā)揮心血管保護(hù)效應(yīng)的重要途徑之一。

血管內(nèi)皮損傷；17β-雌二醇；氧化應(yīng)激； PI3K/Akt信號通路

中國的女性死因排序中，心血管疾病死亡率已超過了腦卒中和腫瘤，成為首位死亡原因。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)，也是很多心血管疾病的病理基礎(chǔ)。近年來活性氧自由基對血管內(nèi)皮的損傷作用已引起人們的廣泛重視，在一些損傷因素的作用下，細(xì)胞內(nèi)氧化代謝物增加，或細(xì)胞中抗氧化保護(hù)機(jī)制不足時，使活性氧(ROS)產(chǎn)生堆積并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，這種氧化和抗氧化的不平衡狀態(tài)稱之為氧化應(yīng)激。活性氧可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損凋亡，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和防止其凋亡，對防止心血管疾病具有重要的意義。雌激素(estorgen，E)具有保護(hù)女性心血管系統(tǒng)、防止和延緩動脈粥樣硬化形成以及提高女性冠狀動脈硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)患者生存率和生活質(zhì)量的作用，絕經(jīng)后的婦女接受雌激素替代療法能降低患冠心病的風(fēng)險達(dá)40%～50%[1，2]，使女性死亡率下降89%[3]。血管內(nèi)皮損傷是引發(fā)動脈粥樣硬化和血管再狹窄的重要原因[4]，已有研究提示17β-雌二醇可明顯縮小球囊損傷術(shù)后的內(nèi)皮損傷面積[5]，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。

近年研究認(rèn)為，雌激素對血管內(nèi)皮的保護(hù)作用可能來自兩個方面：一是促進(jìn)血管內(nèi)皮功能恢復(fù)，二是促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷修復(fù)[5]，但作用機(jī)制不清。雖然雌激素在心血管領(lǐng)域的研究不少，但雌激素對血管內(nèi)皮的損傷后保護(hù)作用機(jī)制目前研究尚不完全清楚，本研究旨在探討雌激素對過氧化氫引起的內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用和可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心，Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶為美國GIBCO公司產(chǎn)品，17β-雌二醇購自美國Sigma公司，CCK-8購自碧云天試劑公司，小牛血清購自Hyclone公司，渥曼青霉素購自Alexis公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞采用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置入37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，所有實驗檢測于培養(yǎng)3 d～4 d細(xì)胞達(dá)80%～90%融合狀態(tài)后進(jìn)行。

1.2.2 實驗分組 空白對照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)，含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；過氧化氫損傷組：將培養(yǎng)融合狀態(tài)達(dá)到80%～90%的HUVEC，每孔加入終濃度為0.75 mmol/L的H2O2；H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)組：H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L；單純17β-雌二醇組：17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L； H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組：H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L，渥曼青霉素終濃度100 nmol/L。

1.2.3 Western-blot檢測細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白含量變化 不同干預(yù)后，檢測各組PI3K/Akt蛋白的含量，按照試劑盒操作說明逐步操作，提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行濃度測定，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)和曝光，利用Quantity one 圖像分析軟件分析實驗結(jié)果。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞接種于96孔板，無血清培養(yǎng)24 h后，棄無血清培養(yǎng)液，暴露于含H2O2的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；17β-雌二醇與渥曼青霉素在暴露前6 h加入。培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)液中按1∶10比例加入CCK-8液，37 ℃孵箱繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢查每孔的吸光度OD值。細(xì)胞存活率(%)=處理組OD值/對照組OD組×100%。

1.2.5 Annexin-V/PI聯(lián)合染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞接種于6孔板，不同處理后，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，0.25%胰蛋白酶消化1 min，含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加Annexin-V/PI液，避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVEC內(nèi)ROS含量 細(xì)胞按1×105/mL密度接種于6孔板，每孔1 mL。收集各組細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，各孔加入1 mL濃度為10 μmol/L的DCFH-DA探針，繼續(xù)孵育20 min，然后用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，PBS液洗滌1次，0.25%胰蛋白酶500 mL消化2 min，冰浴終止消化，移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量Barfer，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的量。

1.2.7 熒光探針標(biāo)記法測定HUVEC內(nèi)ROS活性 具體探針標(biāo)記方法同上，用無血清培養(yǎng)液及PBS也洗滌以后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 Western-blot檢測細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白含量變化 H2O2損傷引起的氧化應(yīng)激可以刺激細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白表達(dá)輕度上調(diào)，從而發(fā)揮抗氧化作用，與空白對照組相比，H2O2損傷組PI3K表達(dá)0.540±0.033、0.570±0.039，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Akt表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.560±0.038 vs 0.310±0.011，P<0.05)。H2O2損傷在有17β-雌二醇保護(hù)劑條件下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)通路蛋白PI3K、Akt表達(dá)明顯升高(0.850±0.046、0.740±0.042，P<0.001)。詳見圖1。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)組；D為17β-雌二醇組。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護(hù)組、17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組比較，P<0.001。

圖1 Western-blot檢測細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白含量變化

2.2 CCK-8檢測細(xì)胞存活率 17β-雌二醇可以明顯減少氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞存活率(見圖2)。加入CCK-8試劑后，培養(yǎng)孔中活細(xì)胞數(shù)越多，對應(yīng)的450 nm處吸光度值越高。實驗表明，不同干預(yù)組細(xì)胞的存活率不同，氧化應(yīng)激損傷組細(xì)胞存活率最低，細(xì)胞活性為對照組的(30.95±1.95)%，氧化應(yīng)激損傷組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。加入17β-雌二醇，可以明顯減少氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷死亡，細(xì)胞存活率明顯提高為對照組的(72.63±3.51)%，H2O2+17β-雌二醇組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而H2O2+17β-雌二醇組加入PI3K/Akt抑制劑渥曼青霉素細(xì)胞存活率又有所下降，為(42.50±2.28)%。H2O2損傷組與H2O2加17β-雌二醇組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，H2O2損傷組與H2O2+17β-雌二醇+渥曼青霉素組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，H2O2+17β-雌二醇組與H2O2+17β-雌二醇+渥曼青霉素組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)組；D為17β-雌二醇組；E為H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護(hù)組、17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素相比較，P<0.001。

圖2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞活性的結(jié)果

2.3 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測的各不同干預(yù)組細(xì)胞凋亡率不同(見圖3)，H2O2損傷組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，分別為(51.22±1.78)%和(12.18±0.69)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，H2O2損傷組和17β-雌二醇保護(hù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為(51.22±1.78)%和(33.38±1.15)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，損傷加入保護(hù)劑后可以明顯減少細(xì)胞凋亡情況。加入PI3K/Akt抑制劑渥曼青霉素后凋亡率增加，為(41.22±1.32)%，與H2O2損傷組和17β-雌二醇保護(hù)組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)組；D為17β-雌二醇組;E為H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組。右下和右上象限分別代表早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，左下代表正常細(xì)胞。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護(hù)組、17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組比較，P<0.001。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVEC內(nèi)ROS含量 定量檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量不同(見圖4)，H2O2損傷組表達(dá)明顯高于其他組，與對照組和17β-雌二醇保護(hù)組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，Mean值分別為(53.72±1.25)、(16.07±0.61)、(26.38±0.78)，17β-雌二醇可下調(diào)H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)ROS含量，減少氧化應(yīng)激損傷。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護(hù)組；D為17β-雌二醇組。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護(hù)組、17β-雌二醇保護(hù)+渥曼青霉素組相比較，P<0.001。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測DCFH-DA探針標(biāo)記各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量

2.5 熒光顯微鏡觀察HUVEC內(nèi)ROS活性檢測結(jié)果 H2O2損傷可使細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，17β-雌二醇可減弱該作用，定性觀察可見各組ROS染色表達(dá)強(qiáng)度不同，17β-雌二醇可以減弱H2O2損傷導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。

3 討 論

冠心病和高血壓等心血管疾病在絕經(jīng)前女性中的發(fā)病率明顯低于同齡男性[7]。同時發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性的心血管疾病發(fā)病率明顯高于絕經(jīng)前女性，這提示可能與絕經(jīng)期體內(nèi)雌激素水平降低有關(guān)[8]。在動物實驗研究表明雌激素對心血管具有保護(hù)作用[9，10]，這一點在20世紀(jì)90年代關(guān)于絕經(jīng)后女性是否使用雌激素具有保護(hù)心血管的作用的流行病學(xué)研究中得到支持[11-13]，甚至當(dāng)時有觀察性研究提示，絕經(jīng)后女性使用雌激素可以降低高達(dá)50%的心血管疾病危險性[1]，后來Stefanick等[14]關(guān)于使用雌激素和心血管疾病的Meta分析得出結(jié)論，絕經(jīng)后使用雌激素可以減少30%的心血管疾病的發(fā)病率。但是在兩個薈萃分析研究中發(fā)現(xiàn)，既往存在心血管疾病的婦女，在絕經(jīng)后使用雌激素治療并不能起到保護(hù)心血管的作用[15，16]。雌激素對早期的動脈粥樣硬化性心血管疾病具有一級保護(hù)作用，但是對高級別的心血管疾病沒有二級保護(hù)作用。

研究證明雌激素不僅限于對動脈粥樣硬化性心血管病有保護(hù)作用，而且對炎癥性刺激導(dǎo)致的增殖性血管疾病也有保護(hù)作用，如Kaposi肉瘤(KS)，一種罕見的血管增殖性疾病，來源于內(nèi)皮細(xì)胞，HHV8在男女兩性的流行病學(xué)檢出率是一致的[17]，由此看來，雌激素對該種血管疾病的保護(hù)作用要超過對動脈粥樣硬化性心血管疾病的作用。

原則上來說，血管壁的所有組分都對雌激素有反應(yīng)，包括各種血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。雌激素可以影響許多在炎癥性和增殖性血管性疾病中基因的表達(dá)，包括動脈粥樣硬化。直接影響的基因包括細(xì)胞活性分子，例如黏附分子、激素受體，還包括炎癥相關(guān)性，血管重建，血管再生和血管張力相關(guān)的特殊基因表達(dá)。

核因子相關(guān)因子(Nrf22)是一個重要的氧化和電應(yīng)力傳感器，通過調(diào)節(jié)第二階段的防御和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄激活保證氧化還原平衡的維護(hù)[18]。心血管疾病患者細(xì)胞內(nèi)ROS升高，這導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損和一氧化氮的生物利用度降低[19]。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種保護(hù)抗氧化酶，它在動脈粥樣硬化病變中經(jīng)常為過度表達(dá)，并且可被Nrf2調(diào)節(jié)[20]。Nrf2經(jīng)歷易位到細(xì)胞核，與抗氧化基因的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)研究表明，大豆異黃酮的代謝物S-雌馬酚可以激活Nrf2/ARE信號通路，這是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的主要組成部分，這個反應(yīng)是通過PI3K/Akt和ER途徑介導(dǎo)的，表明這可能是大豆異黃酮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的具體機(jī)制[21]。最近的研究表明，Nrf2/ ARE信號通路可能是生物預(yù)防治療動脈粥樣硬化，糖尿病，高血壓和中風(fēng)的一個目標(biāo)通路。其中該信號通路的上游介導(dǎo)通路PI3K/Akt通路在很多細(xì)胞內(nèi)過程中都有參與，包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡。上述研究還表明，加入PI3K/Akt的阻滯劑7，4′-二羥基異黃酮可以阻斷Nrf2的核遷移，這說明Nrf2發(fā)揮核內(nèi)抗氧化作用主要是通過PI3K/Akt通路實現(xiàn)的[21]。本研究中重點檢測該通路重要蛋白PI3K和Akt的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇可以明顯促進(jìn)該通路核心蛋白的表達(dá)，作用同該通路的激活劑，從而使其介導(dǎo)下游通路發(fā)揮抗氧化作用，減輕血管內(nèi)細(xì)胞損傷。

渥曼青霉素是一種真菌代謝產(chǎn)物，其通過與PI3K的催化亞單位p110結(jié)合，非競爭性和不可逆地抑制PI3K激酶活性，從而阻斷PI3K/Akt信號通路，是PI3K的特異性抑制劑[22]。

已有很多研究表明，17β-雌二醇可能在心血管疾病發(fā)病過程中發(fā)揮作用，例如通過增強(qiáng)VEGF-A下游的Norch通路刺激血管新生，通過結(jié)合雌激素受體激活MAPK信號通路的非基因效應(yīng)而促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖。本研究發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇可以明顯提高H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，降低早期和晚期凋亡率，并且減少H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管損傷，說明17β-雌二醇對于過氧化氫導(dǎo)致的血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷確實有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇可以明顯上調(diào)氧化應(yīng)激損傷組內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt的表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的主要通路Nrf2/ ARE信號通路而發(fā)揮抗氧化作用；另外PI3K/Akt信號通路還具有抗細(xì)胞凋亡作用，但在加入該通路的特異性抑制劑渥曼青霉素以后，17β-雌二醇抗氧化損傷的作用明顯減弱，說明PI3K/Akt信號通路可能都是17β-雌二醇抗氧化損傷的機(jī)制通路之一。

總之，雖雌激素可對女性心血管系統(tǒng)有多方面的作用，但對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)在其心血管作用中占有重要地位，抗氧化損傷可能是雌激素產(chǎn)生心血管保護(hù)效應(yīng)的重要途徑。

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(本文編輯 郭懷印)

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)

呂吉元，E-mail:yaya20120710@163.com

R331.3 R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．14．011

1672-1349(2015)14-1616-04

2015-06-25)