孫遠(yuǎn)征,范鴻瑩,劉鐵鐫,武文鵬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

·動(dòng)物實(shí)驗(yàn)·

溫針灸對(duì)嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及前額葉皮質(zhì)區(qū) CaMKⅡ含量的影響

孫遠(yuǎn)征1,范鴻瑩2,劉鐵鐫2,武文鵬1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

目的觀察溫針灸對(duì)嗎啡成癮戒斷后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及前額葉皮質(zhì)區(qū)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)含量的影響,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。方法將40只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、手針組和溫針組,每組10只。模型組、手針組和溫針組大鼠背部皮下注射嗎啡,逐日遞增嗎啡的注射劑量,成癮后給予納洛酮快速戒斷,建立嗎啡成癮戒斷后 SD大鼠模型。采用水迷宮試驗(yàn)測(cè)定各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并采用免疫組化法測(cè)定各組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū) CaMKⅡ含量。結(jié)果對(duì)照組、手針組及溫針組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)及PFC區(qū)CaMKⅡ含量與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。溫針組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)及PFC區(qū)CaMKⅡ含量與手針組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論溫針灸治療可以恢復(fù)嗎啡戒斷后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其作用機(jī)制可能與嗎啡戒斷后前額葉皮質(zhì)區(qū) CaMKⅡ含量增加有關(guān)。

溫針療法;嗎啡依賴;水迷宮;鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ;大鼠

近年來嗎啡成癮成為一個(gè)備受關(guān)注的熱點(diǎn),其所帶來的危害也越來越大。目前醫(yī)學(xué)界對(duì)于成癮有了一個(gè)全新認(rèn)識(shí),認(rèn)為藥物成癮是一種惡性學(xué)習(xí)記憶的過程。一方面,嗎啡成癮對(duì)學(xué)習(xí)記憶會(huì)造成損害;另一方面,多次給予嗎啡又可引起記憶的恢復(fù)和重新鞏固[1-2],一些不好的用藥記憶得到了加深,使成癮者對(duì)藥物產(chǎn)生強(qiáng)烈的渴求,進(jìn)而會(huì)誘發(fā)復(fù)吸。成癮和學(xué)習(xí)記憶之間具有共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,研究證實(shí),Ca2＋-CaM-CaMK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在嗎啡成癮中起到了重要的作用[3]。同時(shí),邊緣系統(tǒng)海馬、杏仁核和前額葉皮質(zhì)(PFC)腦區(qū)/核團(tuán)是調(diào)節(jié)情緒與學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)[4-5]。本研究通過建立嗎啡戒斷后大鼠模型,觀察溫針灸對(duì)嗎啡成癮戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及PFC腦區(qū)CaMKⅡ含量的影響,進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。為針刺治療戒毒尋找更有效的方法以及溫針灸在防止復(fù)吸的應(yīng)用上提供更加可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠40只,體重為(180±20) g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)分組的原則隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、手針組和溫針組,每組10只。每5只飼養(yǎng)于1只籠中,適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期后用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

鹽酸嗎啡(10 mg/mL,批號(hào) H21022436),由沈陽第一制藥廠提供,鹽酸納洛酮(1 mL/mg,批號(hào)H20066624),由吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供;戊二醛,由上海生物工程有限公司提供;多聚甲醛,由上海溶劑廠提供;免疫組化檢測(cè)試劑盒(二抗 PV6001),由北京中山技術(shù)有限公司提供。

1.3 建立大鼠嗎啡戒斷模型

參考有關(guān)文獻(xiàn)[6],本實(shí)驗(yàn)采用背部皮下注射嗎啡的方法。第1天嗎啡注射劑量為20 mg/kg,以后每日遞增10 mg/kg,連續(xù)注射5 d,每日所需劑量分2次注射(上午8:00及下午4:00)。于末次注射嗎啡后3 h,腹腔注射納洛酮3 mg/kg快速戒斷,激發(fā)戒斷癥狀。參照改良柳田知司法,觀察戒斷癥狀(濕狗樣抖動(dòng)、站立、跳躍、洗臉、齒顫、激惹、腹瀉等),進(jìn)行評(píng)分,確定模型建立成功。對(duì)照組于每天相同時(shí)間、相同方法注射同劑量的生理鹽水。

1.4 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物處理

1.4.1 溫針組

將大鼠固定于治療臺(tái)上,按照《大鼠穴位圖譜》[7]取百會(huì)及雙側(cè)腎俞、足三里穴,采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.35 mm×13 mm毫針進(jìn)行針刺,得氣后在針尾纏繞艾絨點(diǎn)燃施灸15 min。每日1次,連續(xù)治療6 d。

1.4.2 手針組

取穴同溫針組,針刺得氣后留針 15 min。每日 1 次,連續(xù)治療6 d。

此外,對(duì)照組及模型組大鼠采用與溫針組相同方法固定,每次15 min,每日1次,連續(xù)6 d,期間不施加其他任何干預(yù)措施。

1.5 指標(biāo)觀察與檢測(cè)

1.5.1 PFC區(qū)CaMKⅡ含量的測(cè)定

采用PV 免疫組化二步法,按試劑盒步驟操作。采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析,測(cè)定PFC區(qū)CaMKⅡ的平均灰度值(平均灰度值與蛋白含量成反比)。

1.5.2 水迷宮測(cè)試

①于治療第 3日開始定位航行試驗(yàn),測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)能力。將大鼠面向池壁,隨機(jī)從不同象限置入池內(nèi),記錄在1 min內(nèi)大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期(前2 d訓(xùn)練中,若1 min內(nèi)不能找到平臺(tái),可幫助其找到平臺(tái),并停留10 s)。②于第6日進(jìn)行空間探索試驗(yàn),測(cè)試大鼠空間記憶能力,即撤除平臺(tái),將大鼠由任一象限置入水中,記錄1 min內(nèi)大鼠的游泳軌跡及跨越平臺(tái)次數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠戒斷癥狀比較

由表1可見,嗎啡迅速戒斷后,除對(duì)照組無明顯戒斷癥狀外,模型組、手針組及溫針組均具有明顯戒斷癥狀(P＜0.01),說明大鼠嗎啡戒斷模型建立成功,可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要。

表1 各組大鼠嗎啡戒斷癥狀評(píng)分比較 (±s,分)

表1 各組大鼠嗎啡戒斷癥狀評(píng)分比較 (±s,分)

注:與對(duì)照組比較1)P＜0.01

組別 n 戒斷癥狀評(píng)分值對(duì)照組 10 1.70±0.68模型組 10 27.11±4.201)手針組 10 27.00±6.481)溫針組 10 22.44±4.561)

2.2 水迷宮測(cè)試結(jié)果

2.2.1 各組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期比較

隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加,各組大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期有了明顯的變化。由表2可見,模型組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較,手針組和溫針組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期均明顯縮短(P＜0.01),提示手針組和溫針組改善大鼠空間學(xué)習(xí)能力均優(yōu)于模型組。溫針組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期與手針組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期比較 (±s,s)

表2 各組大鼠平臺(tái)逃避平均潛伏期比較 (±s,s)

注:與模型組比較1)P＜0.01;與手針組比較2)P＜0.05

組別 n 第3天 第4天 第5天對(duì)照組 10 18.93±7.591) 14.96±4.631) 10.04±3.451)模型組 10 50.52±6.46 47.91±4.27 44.03±4.39手針組 10 37.95±11.861) 31.31±8.841) 27.99±9.271)溫針組 10 33.82±8.981)2) 28.08±7.901)2) 24.65±6.811)2)

2.2.2 各組大鼠穿臺(tái)次數(shù)比較

撤除平臺(tái)后,各組大鼠依照記憶尋找原平臺(tái)。由表3可見,模型組大鼠穿臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較,手針組和溫針組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯增加(P＜0.01),提示手針組和溫針組改善大鼠空間記憶能力優(yōu)于對(duì)照組。溫針組大鼠穿臺(tái)次數(shù)與手針組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠穿臺(tái)次數(shù)比較 (±s,次)

表3 各組大鼠穿臺(tái)次數(shù)比較 (±s,次)

注:與模型組比較1)P＜0.01;與手針組比較2)P＜0.05

組別 n 穿臺(tái)次數(shù)對(duì)照組 10 6.25±1.331)模型組 10 2.11±1.28手針組 10 3.22±1.731)溫針組 10 4.39±1.501)2)

2.3 各組大鼠PFC區(qū)CaMKⅡ含量比較

由表 4可見,對(duì)照組、手針組及溫針組大鼠 PFC 區(qū) CaMKⅡ含量與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。溫針組大鼠PFC區(qū)CaMKⅡ含量與手針組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 各組大鼠PFC區(qū)CaMKⅡ含量比較 (±s,mg/L)

表4 各組大鼠PFC區(qū)CaMKⅡ含量比較 (±s,mg/L)

注:與模型組比較1)P＜0.01;與溫針組比較2)P＜0.05

組別 n 平均灰度值對(duì)照組 10 183.67±9.351)模型組 10 146.33±10.97手針組 10 158.50±7.181)溫針組 10 172.50±9.731)2)

3 討論

CaMKⅡ是一種多功能的蛋白激酶,其自身磷酸化狀態(tài)控制酶的活性參與學(xué)習(xí)記憶的過程,是空間學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)。研究證實(shí)[8-10],慢性嗎啡成癮會(huì)使腦內(nèi)的CaMKⅡ活性降低,嗎啡戒斷則會(huì)使腦內(nèi)CaMKⅡ的活性明顯增高。相關(guān)腦區(qū)內(nèi)CaM和CaMKⅡ活性的過度增高會(huì)影響嗎啡戒斷癥狀的出現(xiàn)[11]。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)納洛酮快速戒斷后,手針組與溫針組大鼠PFC腦區(qū)CaMKⅡ平均灰度值明顯高于模型組,溫針組大鼠 CaMKⅡ平均灰度值更接近于空白組,說明通過溫針治療,嗎啡戒斷后大鼠PFC腦區(qū)內(nèi)過度增高的CaMKⅡ活性降低到接近正常水平。溫針灸作用于嗎啡戒斷的機(jī)制可能與 PFC腦區(qū)內(nèi)CaMKⅡ含量的改變有關(guān)。本次水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示,經(jīng)治療后,嗎啡戒斷大鼠的學(xué)習(xí)記憶損害得到恢復(fù),且溫針灸組的療效更顯著。筆者推測(cè)嗎啡戒斷后大鼠PFC腦區(qū)內(nèi)CaMKⅡ活性過度增高可能與嗎啡戒斷后腦內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變有關(guān)[12],引起嗎啡成癮惡性記憶的形成,影響了大鼠正常的學(xué)習(xí)記憶能力。

艾灸具有溫經(jīng)通絡(luò)、扶正祛邪、行氣活血、調(diào)節(jié)各臟腑功能及增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力等作用[13-16]。針刺本身作為一種有效的刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法,對(duì)嗎啡戒斷癥狀有明顯的改善作用[17-19],根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究及經(jīng)絡(luò)特性選取足三里、腎俞、百會(huì)穴,結(jié)合針刺與艾灸的雙重功效,集針、灸作用于一體。在我們的研究中發(fā)現(xiàn),溫針對(duì)嗎啡戒斷的治療作用非常顯著,可以恢復(fù)其伴隨戒斷癥狀出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶能力損害。本研究為溫針改善嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提供了較為重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),溫針灸可以成為臨床上防止復(fù)吸的一種有效治療方法,但有關(guān)溫針灸對(duì)嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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Effect of Warm Needling on Learning and Memory Abilities and the CaMKⅡ Content of Prefrontal Cortex Area in Morphine Withdrawal Rats

SUN Yuan-zheng1, FAN Hong-ying2, LIU Tie-juan2, WU Wen-peng1. 1.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China; 2.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040,China

ObjectiveTo investigate the effect of warm needling on learning and memory abilities and the calmodulin kinaseⅡ(CaMK Ⅱ) content of prefrontal cortex area in morphine withdrawal rats and explore the mechanism of its action.MethodsForty clean-grade male SD rats were randomly allocated to control, model, manual needling and warm needling groups, 10rats each. A SD rat model of morphine addiction and withdrawal was made by dorsal subcutaneous injection of day-by-day incremental morphine and rapid withdrawal with Naloxone after addiction. Learning and memory abilities were tested using a Morris water maze and the CaMKⅡ content of prefrontal cortex area was measured by an immunohistochemical method in every group of rats.ResultsThere were statistically significant differences in mean platform escape latency, the number of platform crossing and the CaMKⅡ content of PFC area between the control, manual needling or warm needling group of rats and the model group (P＜0.01). There were statistically significant differences in mean platform escape latency, the number of platform crossing and the CaMKⅡ content of PFC area between the warm needling and manual needling groups (P＜0.05).Conclusions Warm needling treatment can restore learning and memory abilities in morphine withdrawal rats. The mechanism of its action may be related to an increase in the CaMKⅡ content of prefrontal cortex area.

Needle warming therapy; Morphine dependence; Water maze; Calmodulin kinaseⅡ; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.03.0253

1005-0957(2015)03-0253-03

2014-10-12

黑龍江省教育廳基金項(xiàng)目(12521496);哈爾濱市科技局項(xiàng)目(2012RFQXS052);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(2012RCQ04)

孫遠(yuǎn)征(1957 - ),男,主任醫(yī)師

武文鵬(1982 - ),男,主治醫(yī)師