高慧

（菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東菏澤274000）

白藜蘆醇通過Sirt-1降低卵巢上皮細胞癌侵襲性作用機制的研究

高慧

（菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東菏澤274000）

目的探討白藜蘆醇對卵巢上皮細胞癌侵襲能力的影響。方法人卵巢癌細胞分為三組，低轉(zhuǎn)移組，高轉(zhuǎn)移組，高轉(zhuǎn)移+白藜蘆醇組，分別提取蛋白和RNA，Western Blot測定MMP-7、Sirt-1、AP-1的蛋白表達水平，RT-PCR測定MMP-7的基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果白藜蘆醇可以明顯的激活高轉(zhuǎn)移卵巢上皮細胞癌當中Sirt-1的作用，與高轉(zhuǎn)移組相比，Sirt-1的表達明顯增加（P＜0.05），白藜蘆醇抑制卵巢上皮細胞癌當中AP-1和MMP-7的表達（P＜0.05）。結(jié)論白藜蘆醇具有明顯的降低卵巢上皮細胞癌侵襲性的藥理作用，這種作用和其上調(diào)Sirt-1的表達密切相關(guān)。

白藜蘆醇；去乙?；?；MMP-7；AP-1

目前在臨床上，卵巢癌的診斷仍然存在著一定的困難。多數(shù)情況下，當卵巢癌發(fā)展到中晚期的時候才能夠確診，此時的治療手段已經(jīng)非常有限，影響患者預后[1]。因此，探索卵巢癌更為有效的診斷和治療方法就顯得非常重要，而闡明卵巢癌的發(fā)病機制則有可能為卵巢癌的診斷和治療方法帶來革命性的進展。白藜蘆醇是一種生物活性很強的天然多酚類物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)它也是腫瘤的化學預防劑，對于很多腫瘤細胞，比如肺癌、肝癌、結(jié)腸癌以及乳腺癌等。白藜蘆醇可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移以及誘導腫瘤細胞的凋亡[2,3]，但是白藜蘆醇對于卵巢癌的作用報道較少，且抗腫瘤的具體機制尚未完全闡明。為此，我們對其進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源低轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910，高轉(zhuǎn)移人卵巢O-8910pm，購自中國科學院上海細胞研。

1.1.2 主要試劑核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒：北京碧云天生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白定量試劑盒：大連波利盾生物技術(shù)有限公司。RNA穩(wěn)定劑：大連波利盾生物技術(shù)有限公司。RT-PCR試劑盒和PCR引物均購自大連寶生物有限公司。兔抗鼠Sirt-1抗體：美國Abcam公司。兔抗鼠AP-1抗體：美國Bioworld公司。兔抗鼠β-actin抗體：美國Santa Cruz公司。山羊抗兔二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL顯色試劑盒：大連波利盾生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備SCP7OH低溫超速離心機：日本HITACHI公司。TS-A脫色搖床：江蘇金壇中大儀器廠。電泳儀及膠架：大連競邁生物科技有限公司。9700型RT-PCR儀器：美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)HO-8910及HO-8910pm細胞在含有10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天傳代一次。

1.2.2 藥物處理與分組將對數(shù)生長期的細胞分為三組，低轉(zhuǎn)移對照組、高轉(zhuǎn)移模型組和高轉(zhuǎn)移白藜蘆醇處理組，低轉(zhuǎn)移組細胞為HO-8910細胞（只加入10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)），高轉(zhuǎn)移組細胞為HO-8910pm細胞（只加入10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)），高轉(zhuǎn)移白藜蘆醇處理組細胞為HO-8910pm細胞（在加入10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中同時加入40μmol/L白藜蘆醇培養(yǎng)）。

1.2.3 Western Blot測定去乙?；福⊿irt-1）、AP-1、MMP-7蛋白表達水平藥物處理完成后，收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取胞漿蛋白以及核蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，將每一樣本的蛋白濃度定量至5μg/μL，然后進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后根據(jù)膠上Maker的位置裁取大小合適的分離膠，并且裁取大小與分離膠一致的濾紙和PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，蛋白封閉液封閉2 h時，用TTBS將封閉液沖洗干凈，一抗4℃過夜，TTBS沖洗三遍，二抗37℃孵育2 h，然后使用ECL試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。1.2.4 RT-PCR測定MMP-7、Sirt-1的基因轉(zhuǎn)錄水平收集細胞，使用RT-PCR試劑盒提取RNA，分光光度法檢測完RNA純度以及完整性之后，配置RTPCR反應體系，并在體系中加入引物（MMP-7上游引物序列：5’-CGGCATCCAGGTTATCGGGG-3’，下游引物序列：5’-TGGGCAACAAATATGAGAGAGC-3’，Sirt-1上游引物序列：5’-CCCAGCTCCAGTCAGAACTAT-3’Sirt-1下游引物序列：5’-TTGGCACCGATCCTCGAAC-3’），然后進行RT-PCR，RTPCR結(jié)束后進行瓊脂糖電泳凝膠并進行成像分析。

1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS20.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Western-blot檢測白藜蘆醇對卵巢上皮細胞癌MMP-7蛋白表達的影響低轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910中，MMP-7有一定數(shù)量的表達，但總體水平較低。與低轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株相比，在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，MMP-7的表達明顯上升（P＜0.01），經(jīng)過白藜蘆醇的處理之后，在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，MMP-7的表達明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞當中MMP-7的蛋白表達（A：HO-8910細胞；B：HO-8910pm細胞；C：白藜蘆醇處理的HO-8910pm細胞）

2.2 RT-PCR檢測白藜蘆醇對卵巢上皮細胞癌MMP-7基因轉(zhuǎn)錄的影響在低轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910中，MMP-7mRNA的轉(zhuǎn)錄水平較低。而在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，與低轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株相比，MMP-7基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升（P＜0.05），經(jīng)過白藜蘆醇的處理之后，在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，MMP-7轉(zhuǎn)錄水平明顯下降（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組細胞當中MMP-7mRNA的蛋白表達（A：HO-8910細胞;B：HO-8910pm細胞；C：白藜蘆醇處理的HO-8910pm細胞）

2.3 Western-blot檢測白藜蘆醇對卵巢上皮細胞癌AP-1蛋白表達的影響在低轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，AP-1蛋白的表達水平較低。在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，與低轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株相比，AP-1的表達明顯上升（P＜0.05），而經(jīng)過白藜蘆醇的處理之后，在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，AP-1的表達明顯下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細胞當中AP-1的蛋白表達（A：HO-8910細胞；B：HO-8910pm細胞；C：白藜蘆醇處理的HO-8910pm細胞）

2.4 Western-blot檢測白藜蘆醇對卵巢上皮細胞癌Sirt-1蛋白表達的影響在低轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910中，Sirt-1蛋白的表達水平較高。而在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，與低轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株相比，Sirt-1的表達明顯降低（P＜0.01），而經(jīng)過白藜蘆醇的處理之后，在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細胞株HO-8910pm中，Sirt-1的表達明顯上升（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細胞當中Sirt-1的蛋白表達（A：HO-8910細胞；B：HO-8910pm細胞；C：白藜蘆醇處理的HO-8910pm細胞）

3 討論

Sirt-1曾經(jīng)叫做“長壽基因”，廣泛存在于包括卵巢細胞的哺乳動物的細胞中。目前已經(jīng)證實Sirt-1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶，并認為其在很多疾病中扮演者重要的角色，比如冠心病、Ⅱ型糖尿病、器官纖維化以及阿爾茨海默病[4]。但是Sirt-1在惡性腫瘤的發(fā)病過程中的作用尚未完全闡明，目前的一些研究認為Sirt-1的表達對惡性腫瘤有著一定程度的誘導分化凋亡的作用[5]，但是也有一些研究則持有相反的觀點[6]。在卵巢癌細胞當中，Sirt-1的高表達可以在一定程度上抑制卵巢癌細胞的侵襲能力。

白藜蘆醇抑制卵巢癌細胞侵襲性的藥理作用和Sirt-1的激活有著密切的聯(lián)系[7]。在低轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞當中，Sirt-1有著一定數(shù)量的表達，而在高轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞當中，Sirt-1的蛋白表達水平明顯下調(diào)，而經(jīng)過白藜蘆醇的誘導之后，Sirt-1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平有了明顯的提高。實驗數(shù)據(jù)提示白藜蘆醇抑制卵巢癌細胞侵襲能力的藥理作用和Sirt-1的激活有著密切的聯(lián)系，Sirt-1可能是抑制卵巢癌細胞侵襲能力的一個新靶點，我們認為Sirt-1抑制腫瘤細胞增殖的作用主要體現(xiàn)抑制MMP-7的表達。

MMPs來源于包括腫瘤細胞在內(nèi)的多種細胞，它調(diào)控了機體的很多生理功能和病理過程，尤其在器官纖維化或硬化、慢性阻塞性肺疾病、心臟重構(gòu)、腎小球腎炎、腹膜炎、組織潰瘍等結(jié)締組織疾病的發(fā)生和進展過程中起著相當重要的作用[8-10]。目前的研究顯示MMPs的表達同樣與腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MMP-7的高表達往往提示腫瘤細胞具有比較高的增殖及轉(zhuǎn)移能力[11]，實驗當中，低轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞當中的MMP-7的表達呈現(xiàn)出低水平，而高轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞當中的MMP-7表達量明顯升高，而高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞經(jīng)過白藜蘆醇的作用之后，MMP-7的表達水平明顯降低，這也證實了MMP-7的表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。我們用RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平上檢測了MMP-7的表達，證實了在高轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞株當中，MMP-7的轉(zhuǎn)錄水平上升，經(jīng)過白藜蘆醇的作用后，MMP-7的轉(zhuǎn)錄水平下降。白藜蘆醇有著明顯的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，而這種作用與抑制MMP-7的轉(zhuǎn)錄與表達密切相關(guān)。

為了進一步闡明Sirt-1負性調(diào)節(jié)MMP-7表達的分子作用機制。為此，我們對MMP-7上游的轉(zhuǎn)錄因子AP-1做了深入的研究。AP-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，與很多生長因子、細胞因子以及MMP的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)[12,13]。AP-1激活后從細胞質(zhì)移位至細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合[14]，從而激活MMP-7的轉(zhuǎn)錄，導致MMP-7的轉(zhuǎn)錄水平上升。我們的數(shù)據(jù)顯示與低轉(zhuǎn)移細胞相比，在卵巢癌高轉(zhuǎn)移細胞當中，核蛋白中的AP-1表達水平明顯上升，而高轉(zhuǎn)移細胞經(jīng)過白藜蘆醇的治療之后，核蛋白中AP-1的表達明顯下降。這證實了白藜蘆醇抑制了AP-1的激活，從而使MMP-7的表達水平下降。

目前的研究顯示AP-1是Sirt-1的調(diào)控位點之一，Sirt-1與AP-1相互作用，從而抑制AP-1的激活，降低了MMP-7的表達[15,16]。實驗數(shù)據(jù)顯示，在高轉(zhuǎn)移的卵巢癌細胞當中，Sirt-1在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平明顯下調(diào)，經(jīng)過白藜蘆醇的治療，Sirt-1表達水平上升。Sirt-1的激活抑制了AP-1的表達，這與Sirt-1抑制MMP-7的表達呈現(xiàn)出相同的趨勢，這提示Sirt-1抑制MMP-7的表達是通過抑制AP-1的表達實現(xiàn)的。

綜上所述，我們的研究顯示白藜蘆醇具有明顯的抑制卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移的作用，而這種作用與激活Sirt-1的表達從而抑制AP-1和MMP-7的表達密切相關(guān)。

[1]Gmyrek L,Jonska-Gmyrek J,Zolciak,et al.Siwinska A.Therapeutic value of lymphadenectomy in ovarian cancer patients[J].Ginekol Pol. 2014,85(10):788-791.

[2]侯西棟,李紅,許啟泰.白藜蘆醇抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究[J].河南大學學報(醫(yī)學版),2013,9:45-47.

[3]Hotnog D,Mih?il?M,Lancu IV,etal.Resveratrolmodulates apoptosis in 5-fluorouracyl treated colon cancer cell lines[J].Roum Arch Microbiol Immunol.2013,72(4):255-264.

[4]Rehan L,Laszki-Szcz?chor K,Sobieszczańska M,etal.SIRT1 and NAD as regulatorsofageing[J].Life Sci.2014,105(1-2):1-6.

[5]Wang,R.H,Sengupta,K,Li,et al.Impaired DNA damage response, genome instability,and tumorigenesis in SIRT1mutantmice[J].CancerCell,2008,14(4):312-323.

[6]ChenWY1,Wang DH,Yen RC,etal.Tumor suppressor HIC1 direct

ly regulates SIRT1 tomodulate p53-dependent DNA-damage responses[J].Cell,2005,123(3):437-448.

[7]Xia N,Strand S,Schlufter F,etal.Role of SIRT1 and FOXO factors in eNOS transcriptional activation by resveratrol[J].Nitric Oxide，2013,（32）:29-35.

[8]Arriola Benitez PC1,Scian R,ComerciDJ,etal.Brucella abortus induces collagen deposition and MMP-9 down-modulation in hepatic stellate cells via TGF-β1 production[J].Am JPathol,2013,183(6): 1918-1927.

[9]Jia ZB,Tian H,Kang K,et al.Expression of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 by transplanted VSMCsmodifiesheart structure and function after myocardial infarction[J].Transpl Immunol,2014, 30(4):149-158.

[10]DanilewiczM,Wagrowska-DanilewiczM.Differentialglomerular immunoexpression ofmatrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in idiopathic IgA nephropathy and Schoenlein-Henoch nephritis[J]. Folia Histochem Cytobiol,2010,48(1):63-67.

[11]Sakamoto N1,Naito Y,Oue N,etal.MicroRNA-148a is downregulated in gastric cancer,targetsMMP7,and indicates tumor invasivenessand poorprognosis[J].Cancer Sci.2014,105(2):236-243.

[12]Hsieh MJ,Lin CW,Yang SF,etal.Glabridin inhibitsmigration and invasion by transcriptional inhibition ofmatrixmetalloproteinase 9? through modulation of NF-κB and AP-1 activity in human liver cancer cells[J].Br JPharmacol.2014,171(12):3037-3050.

[13]Zhu G,Kang L,Wei Q,et al.Expression and regulation of MMP1, MMP3,and MMP9 in the chicken ovary in response to gonadotropins,sex hormones,and TGFB1[J].Biol Reprod,2014,90(3):57.

[14]Lin CW,Chen PN,Chen MK,etal.Kaempferol reduces?matrixmetalloproteinase-2 expression by down-regulating ERK1/2 and the activator protein-1 signaling pathways in oral cancer cells[J].PLoS One.2013,8(11):e80883.

[15]Jia ZC,Wan YL,Tang JQ,et al.ERK1/2 and p38 MAPK signaling pathways in human colon cancer cell[J].Int JColorectal Dis.2012, 27(4):437-445.

[16]Lee SJ,Kim MM.Resveratrol with antioxidant activity inhibitsmatrixmetalloproteinase viamodulation of SIRT1 in human fibrosarcoma cells[J].Life Sci.2011,88(11-12):465-472.

Resveratrol A ttenuates the M etastasis of Epithelial Ovarian Carcinom a by Sirt-1

Gao Hu i
（HezeMedicalCollege，Heze 274000,Shandong）

ObjectiveTo study the effects of resveratrol in ovarian epithelial carcinoma and explore themolecular mechanism.MethodsHuman ovarian cancer cellswas divided into three groups,(A)low metastasis group(B)highme?tastasis group(C)highmetastasisgroup w ith resveratrol,then extraction protein and RNA respectively,Western blotanaly?siswereused to determine the effectof resveratrolon theexpression levelsof SIRT1,AP-1,and MMP-7 proteinsand RTPCR assay were used to determ ine the genetic transcription level of MMP-7.Resu lts Western Blot analysis and RTPCR revealed that the levelsof MMP-7 and AP-1 were significantly upregulated in highmetastasisovarian epithelial car?cinoma,however resveratrol attenuated the levels of MMP-7 and AP-1（P＜0.05),correspondingly,resveratrol could in?crease the expression of Sirt1(P＜0.05).Conc lusion Resveratrol could inhibitmetastasis of ovarian epithelial carcinoma mediated by Sirt1 activation.

Resveratrol；Sirt-1；MMP-7;AP-1

R373.31；R446.62

A

1008-4118（2015）03-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2015.03.001

2015-05-12