李新海，苑瑞芳，柏 麗，馮登偵

（寧夏大學(xué)動物科學(xué)系，寧夏 銀川 750021）

中衛(wèi)山羊KAP6.2基因的PCR-SSCP分析

李新海，苑瑞芳，柏 麗，馮登偵?

（寧夏大學(xué)動物科學(xué)系，寧夏 銀川 750021）

角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白KAP基因家族是毛生長發(fā)育的重要基因，其中KAP6.2基因影響山羊的絨毛性狀。為研究在中衛(wèi)山羊群體中其對絨毛的影響，本試驗采集187只中衛(wèi)山羊耳組織樣提取DNA，利用PCR-SSCP技術(shù)檢測KAP6.2基因的SNP多態(tài)。試驗檢測到5種基因型，4個等位基因，其中AA（基因型頻率為0.51）為優(yōu)勢基因型，A（等位基因頻率為0.61）為優(yōu)勢等位基因。群體多態(tài)信息含量為0.45，為中等多態(tài)。試驗結(jié)果顯示KAP6.2基因在中衛(wèi)山羊群體中存在中等多態(tài)性，這將為在中衛(wèi)山羊群體中開展絨毛性狀與KAP6.2基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析提供遺傳根據(jù)。

中衛(wèi)山羊；KAP；PCR-SSCP；羊絨；SNP

角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白 KAP（Keratin-associated proteins，KAP）是毛發(fā)的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它們影響著毛發(fā)的物理特性[1-3]。KAP6家族是富含甘氨酸/酪氨酸的Ⅱ型角蛋白[4]。SNP多態(tài)標(biāo)記在畜禽遺傳育種中應(yīng)用很廣泛[5]。張亞妮等（2007）[6]研究了KAP基因的4個SNP多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)絨量上存在優(yōu)勢等位基因。王杰等（2010）[7]研究發(fā)現(xiàn)，KAP6.2的某SNP多態(tài)中，AA基因型的絨長度顯著高于雜合子和另一基因型；BB基因型的絨細(xì)度顯著高于雜合子與另一基因型?？梢姡琄AP6.2基因SNP多態(tài)與山羊絨性狀有相關(guān)。中衛(wèi)山羊是寧夏特有的國家畜禽資源保護(hù)品種，以產(chǎn)白色沙毛裘皮為主。由于禁牧的實施，飼養(yǎng)成本增大，且中衛(wèi)山羊產(chǎn)絨量較低，養(yǎng)殖效益很低，目前中衛(wèi)山羊飼養(yǎng)量少，處于保種狀態(tài)[8]。中衛(wèi)山羊羊絨柔軟細(xì)長，光澤亮白，絨直徑14μm左右，絨長66 mm，含絨量56%，品質(zhì)優(yōu)良，但是絨纖維中兩型毛較多，絨、毛混生，不易分梳，且中衛(wèi)山羊產(chǎn)絨量低，平均單產(chǎn)僅有170～200 g[9]。為提高中衛(wèi)山羊的絨產(chǎn)量，以增加效益減少保種費(fèi)用，擬通過分子標(biāo)記輔助選擇育種來提高其絨產(chǎn)量。本試驗從中衛(wèi)山羊保種群中選取187只進(jìn)行KAP6.2基因的SNP多態(tài)檢測，從而為后期進(jìn)行KAP6.2基因與中衛(wèi)山羊絨毛性狀的關(guān)聯(lián)研究提供遺傳依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 在寧夏中衛(wèi)山羊選育場采集187只中衛(wèi)山羊的耳組織，-20℃保存。

1.2 PCR試驗方法

1.2.1 DNA提取 利用《分子克隆試驗指南》的酚氯仿法提取中衛(wèi)山羊耳組織DNA。

1.2.2 PCR引物 上海生工生物工程股份有限公司合成[10]。

上游引物：TCAGAAACATCCTCTTGCAG下游引物：TAGGCTAAGACGGTGATG

1.2.3 PCR反應(yīng)體系 25μL反應(yīng)體系為：DNA模板1μL，上游與下游引物各1μL，PCR 2× Master Mix混合液（購自北京天根生化科技有限公司，包含酶，dNTP，緩沖液等）12.5μL，雙蒸水9.5μL。

1.2.4 PCR擴(kuò)增程序 95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)（94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s）35個，最后延伸72℃ 10 min。

1.2.5 SSCP過程 PCR產(chǎn)物上樣前變性，在8%聚丙烯酰胺凝膠（30%丙烯酰胺13 mL，超純水30 mL，10×TBE 5mL，10%AP 350μL，TEMED 35μL）中150 v電壓電泳4 h，銀染顯帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用SAS 8.2軟件進(jìn)行卡方檢驗；利用中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所種質(zhì)資源與工程育種室發(fā)布的多態(tài)信息含量計算軟件PIC-Calc 0.6進(jìn)行多態(tài)信息含量計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取和PCR結(jié)果 使用酚氯仿法提取187只中衛(wèi)山羊耳組織的DNA，均提取到合乎質(zhì)量的DNA。

趙苗等（2008）[10]設(shè)計的KAP6.2序列上的引物，在內(nèi)蒙古絨山羊中擴(kuò)增得到了362 bp的片段。利用相同引物對187只中午山羊的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了符合目的片段長度，特異性良好的一條PCR帶，見圖1，可以用于后續(xù)SSCP分析。

1～3為3個樣品經(jīng)PCR后的產(chǎn)物條帶；DNA marker條帶長度由上到下依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp；目的條帶長度為362 bp圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Am plification Result of PCR

2.2 SNP分型結(jié)果 經(jīng)聚丙酰胺凝膠電泳，銀染顯帶后，檢測中出現(xiàn)的所有基因型如圖2所示，共有5種，分別是AA、BB、AB、BC和BD。

圖2 SSCP基因型Fig.2 Genotypes of SSCP

從圖2中可以看到，共有A、B、C、D 4種基因型，其中A和B下面一條帶重合，C與B也有一條帶重合，而D的兩條帶與A、B、C均不重合。理論上存在AA、BB、CC和DD共4種純合子，6種雜合子，但所測個體中上僅出現(xiàn)2種純合子與3種雜合子。

2.3 基因型頻率和基因頻率統(tǒng)計分析 KAP6.2基因在187只中衛(wèi)山羊中檢測到5種基因型、4個等位基因，有AA和BB 2種純合基因型，AB、BC和BD 3種雜合基因型，統(tǒng)計得到基因型頻率和基因頻率見表1。

從表1中可以看到基因型以AA、AB、BB三種為主，尤以AA最多，占到所有個體的一半。A、B是優(yōu)勢等位基因，A基因頻率最高，為61%。

2.4 多態(tài)信息含量計算 見表2。

表1 KAP6.2基因的基因型頻率與基因頻率Tab le1 Genotype frequency and gene frequency of KAP6.2 gene

表2 KAP6.2基因的多態(tài)信息Table2 Polymorphism information of KAP6.2 gene

將等位基因及其頻率按格式輸入PIC-Calc 0.6的文件中，運(yùn)行程序，計算得PI=0.45，為中等多態(tài)。

3 討論

3.1 KAP6.2基因的多態(tài)位點(diǎn) 內(nèi)蒙古絨山羊KAP6.2由675個核苷酸組成，59～352共294個核苷酸編碼96個氨基酸[11]。試驗用引物擴(kuò)增片段為11～372區(qū)段共362 bp的序列，包含了5’端、外顯子和3’端[10]。圖1結(jié)果顯示，可得到條帶清晰單一的目的片段。圖2的SSCP結(jié)果顯示，試驗得到的條帶可見，此段序列共4個等位基因，其中A、C、D分別與B組成了3種雜合子。因此，B分別與A、C、D存在SNP差異，但A、C、D之間的SNP不一定是在同一個位點(diǎn)上，這需要進(jìn)一步的測序驗證。

趙苗等（2008）[10]利用相同引物進(jìn)行的PCR-SSCP分析，結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古絨山羊中出現(xiàn)了AA、BB、AB型，除去影子帶后，與本試驗的A、B帶型相同，但未出現(xiàn)本試驗的C、D等位基因。趙俊星等（2007）[12]擴(kuò)增序列為73～370區(qū)段，共298 bp，包含了外顯子和3’端序列，從SSCP圖譜看，與本試驗圖有很大差別，SNP位點(diǎn)與本試驗有差別。王杰等（2010）[7]設(shè)計藏山羊的SSCP擴(kuò)增序列為73～359區(qū)段，共287 bp，全部在外顯子區(qū)域，而且只得到兩種基因型AA和AB型，其中AA型為優(yōu)勢基因型。由于其片段差異，且SSCP圖譜非常不清楚，無法與本試驗的等位基因位點(diǎn)進(jìn)行比較。

3.2 中衛(wèi)山羊KAP6.2基因雜合度 通過 PCR-SSCP方法對中衛(wèi)山羊群體KAP6.2基因多態(tài)性分析，共檢測出5種基因型，其中純合基因型2種，雜合基因型3種，AA和AB是主要基因型，頻率分別為0.51和0.21；群體的多態(tài)信息含量、雜合度均處于中等水平，表明中衛(wèi)山羊群體的KAP6.2基因的選擇程度不是很大，沒有造成很大的近交純合。趙俊星等[12]在3個山羊品種中檢測的KAP6.2基因多態(tài)在0.35～0.38間，趙苗等[10]的多態(tài)信息含量為0.17，均低于本試驗的0.45。中等程度的多態(tài)信息含量有助于進(jìn)行后續(xù)SNP多態(tài)與絨毛性狀的關(guān)聯(lián)分析。

4 結(jié)論

利用一對引物在中衛(wèi)山羊群體中檢測到KAP6.2基因上存在中度程度多態(tài)，有4個等位基因，其中A為優(yōu)勢等位基因，這將為后續(xù)SNP多態(tài)與絨毛性狀的關(guān)聯(lián)分析提供依據(jù)。

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Polymorphism analysis of KAP6.2 gene in Zhongweigoat

Li Xinhai,Yuan Rui fang,Bai Li,Feng Dengzhen*
（Agricultural Col lege,Ningxia University,Ningxia Yinchuan 750021）

KAPs are genes which play impor tant roles in wool development,and KAP6.2 gene affects the goat’s cashmere.In order to study the association between KAP6.2 SNPs and cashmere traits,187 ear tissue samples f rom Zhongwei goats were col lected,and analysis Zhongwei goat KAP6.2 gene polymorphism were determined by PCR-SSCP technology.Five genotypes and four al leles were detected,AA（f requency is 0.51）is the main genotype,A（f requency is 0.61）is the main allele.Polymorphism information content is 0.45,heterozygosity is 0.37 and ef fective al leles is 2.12 in Zhongwei goats.The resul t shows that KAP6.2 gene presents medium polymorphism in Zhongwei goat,which wi l l provide genetic basis for association analysis between KAP6.2 SNPs and cashmere t raits.

Zhongwei goat;KAP;PCR-SSCP;Cashmere;SNP

S826

1672-9692(2015)08-0032-04

2015-6-14

李新海（1979-），男，漢，講師，博士，主要從事動物遺傳育種研究。

馮登偵（1965-），男，漢，教授，碩士，主要從事動物遺傳育種研究。

寧夏自然科學(xué)基金項目（NZ13035）