李 健，劉 飛，劉大飛，羅其勇，李一經(jīng)，劉春國4,?

1.重慶自然博物館，重慶 400700；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030; 5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001）

H 3N2亞型禽流感病毒分離鑒定及HA和NA基因序列分析

李 健1，劉 飛2，劉大飛5，羅其勇3，李一經(jīng)4?，劉春國4,5?

1.重慶自然博物館，重慶 400700；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030; 5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001）

為了研究野生禽類H 3N 2亞型低致病性禽流感病毒的分子特征，本研究從野鴨糞便樣本中分離到一株禽流感病毒，通過血凝抑制試驗證實分離株為H 3亞型流感病毒，命名為A/Mallard/Q iqihaer/0726/2013(H 3N 2)。對其血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因進行了克隆和序列分析，核苷酸序列比對結(jié)果表明分離株HA基因與H 3N 8亞型A/M al?lard/SanJiang/90/2006(H 3N 8)的同源性最高，達到99.5%，NA基因與H 5N 2亞型A/northern pintail/Akita/714/2006 (H 5N 2)的同源性最高，達到99.4%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析進一步證實分離株的HA和NA基因可能分別來自于H 3N 8亞型和H 5N 2亞型禽流感病毒，是一株重排病毒。本研究為H 3N 2亞型禽流感病毒的遺傳進化機制提供了理論數(shù)據(jù)。

野鴨；流感病毒；H3N 2亞型；HA基因；NA基因；重排

禽流感病毒（Avian inf luenza virus,AIV）屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，水禽是其自然儲存宿主，尤其是野生水禽，其在流感病毒的進化中發(fā)揮著重要作用。目前已證明AIV有17個血凝素（Hemagglutinin,HA）亞型和10個神經(jīng)酸酶亞型[1-2]。在這些亞型中除了大部分H5和H7亞型為高致病性AIV外，其他的均為低致病性AIV。而在低致病性AIV中，H3亞型AIV是最常見的，占有主要優(yōu)勢。H3亞型流感病毒能夠感染豬、人、禽、犬、貓、馬和海豹等多種宿主[3-7]。重排在流感病毒進化過程中發(fā)揮重要作用[2,8-9]。研究表明H3亞型AIV通過重排能夠直接感染人[10]。1968年香港H3N2亞型流感大流行毒株就是由重排而來[11]。因此，對H3亞型流感病毒進行監(jiān)測對了解流感病毒的遺傳進化機制和發(fā)現(xiàn)具有潛在威脅的遺傳重排毒株的出現(xiàn)具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究對齊齊哈爾扎龍自然保護區(qū)的野鳥糞便樣本進行禽流感病原流行病學(xué)調(diào)查時分離到一株H3N2亞型AIV，并對其HA和NA基因序列進行了分子和遺傳分析。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和拭子 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制劑、pMD-18T載體等購自大連寶生物工程公司；AxyPrep體液病毒RNA小量制備試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；H3N2亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；野鴨糞便采自齊齊哈爾扎龍自然保護區(qū)。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中H3N2亞型AIV HA基因的核苷酸序列，應(yīng)用primer premier 6.0軟件設(shè)計引物，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄引物序列uni-12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。HA基因引物序列：HA-up：5’-AGCAAAAGCAGGGGATACCTGC-3’，HA-low：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTGTAATTATC-3’。NA基因引物序列：NA-up：5’-TTGCTTGGTCGGCAAGTGC-3’，NA-low：5’-CCAGTCCACCCATTTGGATCC-3’。

1.3 病毒分離及HA亞型鑒定 野鴨糞便用PBS按1∶5稀釋后，離心，上清用0.22μm的濾膜進行過濾，濾液按常規(guī)方法接種11日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0.2 mL，37℃孵育，每天觀察，72 h后，收集雞胚尿囊液，測定血凝效價。將具有血凝價的雞胚尿囊液與H3N2亞型AI標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進行HI試驗，將反應(yīng)陽性的尿囊液分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒核酸提取及cDNA的制備 參考AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒說明書提取病毒RNA。然后參考M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書，用uni-12反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA[8]。

1.5 HA和NA基因的擴增及測序 以cDNA為模板，用HA和NA基因特異性引物HA-up/HA-low和NA-up/ NA-low進行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸2 min；共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，隨后用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。切取HA和NA基因特異性條帶，用膠回收試劑盒進行純化，然后連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑選經(jīng)菌落PCR鑒定陽性的菌液送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。

1.6 HA和NA基因的分子及遺傳特征分析 將測序結(jié)果用Lasergene軟件中的SeqMan程序進行序列拼接，然后進行Blast比對。從流感數(shù)據(jù)庫中下載H3N2亞型AIV參考毒株的HA和NA基因序列，用Lasergene軟件中的MegAl ign程序?qū)A和NA基因基因核苷酸和氨基酸序列進行同源性比對。用MEGA5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建HA和NA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果和分析

2.1 病毒的分離鑒定 野鴨糞便樣本接種雞胚后收集的尿囊液能夠凝集雞紅細(xì)胞，HA效價能夠達到1∶256。H3N2亞型AI標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能夠抑制病毒的凝集效應(yīng)，HAI效價達到1∶512，證明尿囊液中含有H3亞型AIV。2.2 HA和NA基因的PCR鑒定 用H3N2亞型AIV HA和NA基因特異性引物對制備的cDNA進行PCR擴增，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，可見在1 700 bp和1 400 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1）。

圖1 HA和NA基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR p roduct of HA and NA gene

2.3 HA和NA序列分析 測序結(jié)果分析顯示，HA基因全長1 765 nt，編碼區(qū)位于30～1 730 nt之間，長1 701 nt，共編碼566個氨基酸。NA基因全長1 413 nt，編碼區(qū)長1 410 nt，位于20-1 429 nt之間，共編碼469個氨基酸。對HA基因核酸序列分析表明，分離株A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013（H3N2）與參考株A/Mal lard/SanJiang/90/2006（H3N8）的同源性最高，為99.5%，而氨基酸序列同源性最高的毒株為A/duck/Mongol ia/OIE-7799/2011（H3N2），達到98.9%。對NA基因核酸序列分析表明，分離株A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013（H3N2）與參考株A/ nor thern pintai l/Akita/714/2006（H5N2）的同源性最高，達到99.4%，而氨基酸序列同源性最高的毒株為A/duck/Shimane/19/2006（H5N2），達到99.6%（表1）。氨基酸序列進一步分析表明HA蛋白共有6個潛在的N糖基化位點，分別為第8位NST、22位NGT、38位NAT、165位NVT、285位NGS和483位NGT，與A/Duck/Hei longj iang/1/2014（H3N2）的基本相同[12]，而與A/Duck/Ukraine/1/63（H3N8）比較，在81位缺少一個糖基化位點。NA蛋白共有5個潛在的N糖基化位點，分別為61位NIT、69位NNT、70位NTT、146

位NGT和234位NGT。NA蛋白推衍的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)除了參考株A/chicken/Nanchang/3-120/2001（H3N2）和A/duck/Zhej iang/D13/2013（H3N2）的63ITEI65位氨基酸發(fā)生缺失外，包括本研究中的分離株在內(nèi)的其余所有毒株均為發(fā)生缺失?？乖稽c分析發(fā)現(xiàn)，分離株與A/swine/Inner_Mongol ia/547/2001（H3N2）的完全相同，而與A/Duck/Ukraine/1963（H3N8）相比，分離株的抗原決定簇A和B區(qū)的氨基酸位點均發(fā)生一定程度的改變。A區(qū)S137N，B區(qū)N145S；受體結(jié)合位點226及228位均為Q和G[12]。HA裂解位點均為PEKQTRGLF[13]。

2.4 HA和NA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 根據(jù)分離株A/ Mal lard/Qiqihaer/0726/2013（H3N2）的HA和NA基因核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明分離株HA基因與A/Mal lard/SanJiang/90/2006（H3N8）的親緣關(guān)系最近（圖2），NA基因與A/garganey/SanJiang/160/ 2006（H5N2）的親緣關(guān)系最近（圖3）。HA和NA基因均與亞洲國家分離株的對應(yīng)基因共處于同一進化分支內(nèi)，而與美洲H3N2亞型AIV的相應(yīng)基因處于不同的進化分支。

3 討論

表1 分離株HA和NA基因同源性序列比較Table1 Sequence com parisons o f HA and NA genes of the isolate w ith its closest genetic re latives

圖2 HA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree o f HA gene

野鳥是流感病毒的自然儲存宿主，多種亞型AIV在野鳥不斷分離到，并為流感病毒的重排提供基因片段，導(dǎo)致可能具有高致病性新毒株的出現(xiàn)，造成重大公共衛(wèi)生事件[14]，因此，野鳥在AI的流行中扮演重要角色。H3N2亞型AIV屬于低致病性流感亞型，在野鳥以及家養(yǎng)水禽中普遍存在。近年來具有重排特征的H3N2亞型AIV不斷被發(fā)現(xiàn)，這增加了重排毒株流行的潛在風(fēng)險，因此，開展H3N2亞型低致病性AI的分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要的理論和實踐意義。

本研究從野鴨糞便樣本中分離到一株H3N2亞型AIV，分子分析發(fā)現(xiàn)HA蛋白裂解位點為PEKQTRGLF，具有低致病性AIV的分子特征?？乖稽c分析發(fā)現(xiàn)該毒株與A/swine/Inner_Mongol ia/ 547/2001（H3N2）的完全相同，而與A/Duck/Ukraine/ 1963（H3N8）相比，分離株的抗原決定簇A和B區(qū)的氨基酸位點均發(fā)生一定程度的改變。同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明該毒株是一株重排的病毒。其HA基因來源于亞洲H3N8亞型AIV，NA基因來源于亞洲H5N2亞型AIV。這些變異表明，隨著時間遷移，病毒在環(huán)境、宿主以及自身的選擇壓力下也在發(fā)生著適應(yīng)性進化。

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Isolation，identification and sequence analysis ofa H3N2 subtype influenza virus originated from w ild duck

Li Jian1,Liu Fei2,Liu Dafei5,Luo Qiyong3,Li Yi j ing4*,Liu Chunguo4,5*
(1.Chongqing natural history museum,Chongqing 400700; 2.Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241; 3.Guangxi University of science and technology,Guangxi Liuzhou 545006; 4.Col lege of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Hei longj iang Harbin 150030; 5.Haerbin Veterinary Research Institute,CAAS,Hei longj iang Harbin 150001）

To investigate the genetic characteristics of H3N2 subtype avian inf luenza virus (AIV),the isolation of viruses f rom wi ld duck fecal samples was carried out.A H3N2 subtype AIV A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013(H3N2) was isolated and identi fied by hemagglutination inhibition tests and sequencing.The hemagglutinin(HA)and neuraminidase(NA)genes were cloned and analyzed.The resul ts showed that the HA gene of A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013(H3N2)was closely related with A/Mal lard/SanJiang/90/2006(H3N8)with the highest homology of 99.5%,and the NA gene was closely related with A/nor thern pintail/Akita/714/2006(H5N2)with the highest homology of 99.4%.Phylogenetic tree analysis further conf irmed that the HA and NA genes of A/Mal lard/Qiqi-haer/0726/2013(H3N2)derived f rom H3N8 and H5N2 subtype wild bird AIV,respectively.The present research has provided new theoretical data for the H3N2 subtype of AIV genetic evolution mechanism.

Wi ld duck;Inf luenza virus;H3N2 subtypes;HA gene;NA gene;Reassor tment

S855.3

1672-9692(2015)08-0001-06

2015-05-30

李健（1979-），男，博士生，館員，主要從事野生動物生態(tài)學(xué)研究。

劉春國（1978-），男，博士，助理研究員，主要從事自然疫源性人獸共患病研究。

李一經(jīng)（1960-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物微生物與免疫學(xué)研究。

黑龍江省博士后資助經(jīng)費項目(LBH-Z13043)，中國博士后科學(xué)基金資助項目（2014M561320）