謝明欣，許 紅，畢 雪，朱弘焱，蘇玉虹，田玉民

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

莊河大骨雞生長(zhǎng)激素受體基因內(nèi)含子2多態(tài)性的研究

謝明欣，許 紅，畢 雪，朱弘焱，蘇玉虹，田玉民?

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

為研究莊河大骨雞生長(zhǎng)激素受體（GHR）基因內(nèi)含子2特點(diǎn)，本試驗(yàn)從200只大骨雞血液中提取DNA，PCR擴(kuò)增GHR內(nèi)含子2后進(jìn)行HindⅢ酶切和瓊脂糖凝膠電泳。研究結(jié)果表明，所選取的200只莊河大骨雞GHR基因內(nèi)含子2片段均能得到PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為914 bp；擴(kuò)增產(chǎn)物中具有2個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)，均能獲得3個(gè)酶切片段（529 bp、247 bp和138 bp），因此該酶切位點(diǎn)上無(wú)遺傳多態(tài)性。

莊河大骨雞；GHR基因；內(nèi)含子2；內(nèi)切酶H indⅢ

莊河大骨雞主產(chǎn)于大連莊河市，是在特殊歷史時(shí)期及特定的地理和氣候條件下孕育出的獨(dú)特地方品種。大骨雞具有耐粗飼、耐寒及適應(yīng)力強(qiáng)的特點(diǎn)，以體型大、胸深寬廣、背寬而長(zhǎng)、腿高粗壯、腹部豐滿著稱；所產(chǎn)雞蛋具有蛋大殼紅、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美的特色。隨著大骨雞消費(fèi)市場(chǎng)的擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程加快，市場(chǎng)需求量日益增加。然而，與引進(jìn)的專門化品種/品系相比，對(duì)其研究甚少，制約了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。雖然大骨雞群體的生長(zhǎng)速度較慢、飼料轉(zhuǎn)化率較低，兼具產(chǎn)肉和產(chǎn)蛋性能但其中仍有相當(dāng)?shù)膫€(gè)體具有較高的生產(chǎn)性能。因此，研究大骨雞遺傳特點(diǎn)，對(duì)了解和開發(fā)大骨雞具有重要意義。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，影響雞生長(zhǎng)性狀主要有生長(zhǎng)激素及生長(zhǎng)激素受體。生長(zhǎng)激素（growth hormone,GH是影響動(dòng)物3大物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素其發(fā)揮作用時(shí)必須要與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合即生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptorGHR），然后通過細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起生理反應(yīng)。GHR與促乳素受體、促紅細(xì)胞生成素受體、白細(xì)胞介素受體屬于同一家族，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是受體胞外的200多氨基酸具有顯著的同源性，信號(hào)途徑亦相似。雞GHR基因的cDNA最早是由Burnside等[1]克隆和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)GHR的cDNA全長(zhǎng)為13 kb，具有9個(gè)外顯子（缺少人類的外顯子3），以單拷貝形式存在，共編碼608個(gè)氨基酸（包括16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽），與哺乳動(dòng)物核苷酸序列同源性較低，為50%～58%。研究表明，GHR翻譯的起始點(diǎn)位于內(nèi)含子2上，內(nèi)含子2的多態(tài)性與生長(zhǎng)速度、產(chǎn)蛋量和產(chǎn)雙黃蛋量有關(guān)。鑒于以往研究發(fā)現(xiàn)莊河大骨雞GHR內(nèi)含子2存在HindⅢ酶切位點(diǎn)，因此，本研究擬在獲得產(chǎn)蛋數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，通過分析莊河大骨雞GHR基因片段特點(diǎn)，揭示GHR基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，為育種和遺傳學(xué)研究提供參考和借鑒。凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴箱、PCR擴(kuò)增儀、水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、超純水系統(tǒng)、-70℃超低溫冰箱、微波爐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大骨雞血液基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 取大骨雞靜脈血1 mL，用裂解液、蛋白酶K和SDS進(jìn)行細(xì)胞裂解，用酚、氯仿和異戊醇提取基因組DNA。將提取的大骨雞基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3.2 GHR PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI雞GHR基因序列，選擇內(nèi)含子2為擴(kuò)增靶片段，利用軟件PRIMER 5.0設(shè)計(jì)引物如下：上游引物(F)：5'agt tctatcagtaggcagtaa 3'下游引物(R)：5'at tcaatctatgctcct tcacaaaa 3'

根據(jù)GHR基因序列，利用Primer 5.0分析可知上述擴(kuò)增片段內(nèi)含有內(nèi)切酶HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.3.3 大骨雞GRH基因片段PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表1。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，51.8℃退火45 s，72℃延伸45 s；30～35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品是Marker 2000，紫外燈下觀察并照相。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切 限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切反應(yīng)體系如表2。酶切條件為37℃，3～4 h。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)養(yǎng)殖的莊河大骨雞，隨機(jī)挑選200只健康雌雞單籠飼養(yǎng)于同一雞舍，管理?xiàng)l件完全相同，日糧參照美國(guó)NRC營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑 蛋白酶K、瓊脂糖、DL2000 Marker限制性內(nèi)切酶HindⅢ、PCR用Mix、上下游引物等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；其他均為分析純?cè)噭?。試?yàn)儀器均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口設(shè)備，如超

表1 大骨雞GRH基因內(nèi)含子2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab le1 PCR reaction system for GHR intron 2 of Zhuanghe Dagu chicken

1.3.5 PCR產(chǎn)物酶切后電泳 用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行酶切產(chǎn)物的電泳，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品是Marker 2000，紫外燈下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 大骨雞血液基因組DNA質(zhì)量檢測(cè) 大骨雞血液DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 大骨雞血液基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genome DNA for blood samp les of Zhuanghe Dagu chicken

圖1可見大分子量的DNA條帶，為基因組DNA。

2.2 大骨雞GHR基因內(nèi)含子2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 采用作者設(shè)計(jì)的引物，PCR擴(kuò)增大骨雞GHR基因內(nèi)含子2的部分片段，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖2 大骨雞GRH基因內(nèi)含子2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR of GHR intron 2 in Zhuanghe Dagu chicken

由圖2可見，PCR產(chǎn)物大小約為910 bp，符合預(yù)期的擴(kuò)增長(zhǎng)度，可以用來(lái)進(jìn)行RFLP分析。

2.3 PCR產(chǎn)物HindⅢ酶切結(jié)果 本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的PCR上下游引物間的具有兩個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)，因此，大骨雞GRH基因內(nèi)含子2 PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果見圖3，條帶大小為529 bp、247 bp和138 bp。在本試驗(yàn)所檢測(cè)的200個(gè)體中僅出現(xiàn)上述一種帶型，所以本試驗(yàn)所采樣的大骨雞GHR基因內(nèi)含子2片段沒有多態(tài)性。

3 討論與結(jié)論

研究表明，GHR基因多態(tài)性與來(lái)航雞的早期體重、蛋雞開產(chǎn)至273日齡產(chǎn)蛋量相關(guān)[2]。Hocking等[3]研究發(fā)現(xiàn)GHR作為候選基因與雞產(chǎn)蛋性能、雙黃蛋數(shù)有關(guān)，Kuhnlein等[4]報(bào)道了GHR基因多態(tài)性與雞產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)。而Nagaraja等[5]的研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 GHR基因與雞產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)。國(guó)內(nèi)的葛洪偉等[6]在文昌雞GHR基因內(nèi)含子2發(fā)現(xiàn)了多態(tài)性，并證實(shí)該多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀中的雙黃蛋產(chǎn)量呈顯著相關(guān)。徐文娟等[7]在文昌雞GHR基因內(nèi)含子5中檢測(cè)到多態(tài)性并證明其多態(tài)性與蛋殼厚度顯著相關(guān)。裴勤賢[8]對(duì)興義矮腳雞公雞進(jìn)行GHR基因內(nèi)含子2研究發(fā)現(xiàn)，其多態(tài)性與公雞各周齡體重相關(guān)顯著，與母雞體重相關(guān)不顯著。此外，王洪才等[9]發(fā)現(xiàn)GHR基因內(nèi)含子2序列存在較豐富的多態(tài)性，其多態(tài)性對(duì)莊河大骨雞的產(chǎn)肉性能存在一定的影響。國(guó)內(nèi)其他學(xué)者對(duì)GHR基因與生長(zhǎng)性能之間的關(guān)系及遺傳多樣性也做了一些研究[10-11]。

本試驗(yàn)所擴(kuò)增的是GHR基因內(nèi)含子2的部分片段，在200余只莊河大骨雞中僅檢測(cè)到一種Hind III酶切類型，即2個(gè)酶切位點(diǎn)3個(gè)片段，沒有出現(xiàn)該位點(diǎn)的多態(tài)性。雖然國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究中存在GHR多態(tài)性[9]，可能的原因有：①確實(shí)不存在多態(tài)性；②多態(tài)性基因型頻率低，受200只母雞樣本的限制，未檢測(cè)到多態(tài)性個(gè)體；③所擴(kuò)增的GHR基因片段不同，導(dǎo)致結(jié)果不同。為更確切探明莊河大骨雞GHR基因內(nèi)含子2是否存在多態(tài)性位點(diǎn)，項(xiàng)目組擬進(jìn)一步測(cè)序分析。

GHR作為影響動(dòng)物體生長(zhǎng)的關(guān)鍵成分，GHR基因結(jié)構(gòu)變異可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而影響與GH的結(jié)合，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度降低。自1992年以來(lái)，已有較多的關(guān)于雞GHR結(jié)構(gòu)、多態(tài)性和功能的研究，但還有很多功能尚不清楚，如多態(tài)性與功能的關(guān)系、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞機(jī)制等。因此，需要圍繞雞的GHR進(jìn)行深入地研究，以便為調(diào)控家禽生長(zhǎng)性能、產(chǎn)蛋性能的分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

圖3 大骨雞GRH基因內(nèi)含子2 PCR產(chǎn)物酶切后凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of enzym e digestion for PCR p roducts o f GHR intron 2 in Zhuanghe Dagu chicken

[1]Burnside J,Liou S S,Zhong C,et al.Abnormal growth hormone receptor gene expression in the Sex-l inked dwar f chicken[J].Endocrinol,1992,88(1):20-28.

[2]Feng X P,Kuhnlein U,Faithful l R W,et al.A genetic marker in the growth hormone receptor gene associated with body weight in chickens[J].J Hered,1998,89(4):355-359.

[3]Hocking P M,Bernard R,Wi lkie R S,et al. Plasma growth hormone and insul in-l ike growth factor-I(IGF-I)concent rations at th onset of lay in ad l ibitum and restricte broiler breeder fowl[J].Br Poul t Sci,1994 35:299-308.

[4]Kuhnlein U,Ni L,Weigend S,et al.DNA poly morphisms in the chicken growth hormon gene:response to selection for disease re sistance and association with egg productio [J].Anim Genet,1997,28:116-123.

[5]Nagaraja S C,Aggrey S E,Yao J,et al.Trai association of a genetic marker near the IGF I gene in egg-laying chickens[J]. Hered 2000,91:150-156.

[6]葛洪偉，李碧春，李慧芳，等.文昌雞GHR基因內(nèi)含子和5位點(diǎn)對(duì)文昌雞繁殖性能的遺傳效應(yīng)研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2007，43（19）：8-10.

[7]徐文娟，李亨，朱文奇，等.GHR、IGH-1基因多態(tài)性對(duì)文昌雞蛋品質(zhì)性狀遺傳效應(yīng)的研究[J].中國(guó)畜牧雜志2008，44（17）：1-3.

[8]裴勤賢.雞GH基因和GHR基因多態(tài)性與早期生長(zhǎng)性能的相關(guān)性研究[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2007.

[9]王洪才，袁曉春，宋天玉.莊河大骨雞GHR基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)肉性能的關(guān)聯(lián)分析[J].中國(guó)家禽，2012 34（18）：29-32.

[10]夏祖和，陳清.禽類生長(zhǎng)激素受體基因研究進(jìn)展[J]金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（2）：78-81.

[11]楊志勤，宋悅，竭航，等.家雞生長(zhǎng)激素受體基因外顯子10多態(tài)性分析[J].中國(guó)畜牧雜志，2013，49（15）12-15.

Study on Polymorphism Grow th Hormone Receptor intron 2 in Zhuanghe Dagu Chicken

Xie Mingxin,Xu Hong,Bi Xue,Zhu Hongyan,Su Yuhong,Tian Yumin*
（Col lege of Animal Husbandry&Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001）

In order to study the characteristics of growth hormone receptor(GHR)int ron 2 for Zhuanghe Dagu chicken,DNA were ext racted f rom 200 blood samples of Zhuanghe Dagu chicken and ampl ifed by PCR with primers of GHR int ron 2.The PCR products were digested with enzyme HindⅢand then displayed by agarose gel elect rophoresis.The resul ts showed that al l GHR int ron 2 in 200 samples were ampl i fed by PCR with products of 914 bp.Al l samples showed two enzyme sites of HindⅢ among the product and three f ragments of 529 bp,247 bp and 138 bp in agarose gel.Therefore,there was no Genetic polymorphism.

Zhuanghe Dagu chicken;GHR gene;Intron 2;Enzyme HindⅢ

S831

1672-9692(2015)05-0034-04

2015-04-05

謝明欣（1992-），女，動(dòng)物科學(xué)專業(yè)在讀。

田玉民（1962-），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轱暳腺Y源開發(fā)與利用。

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新課題（201410160016）、遼寧省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2014209006）及遼寧醫(yī)學(xué)院領(lǐng)軍人物資助項(xiàng)目