張 鉑王 兵王勇強(qiáng)曹書華△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192；3.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300060）

·研究報(bào)告·

大黃鞣質(zhì)對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷繼發(fā)腦水腫抑制作用的研究*

張 鉑1，2，3王 兵2王勇強(qiáng)2曹書華2△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192；3.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300060）

目的觀察大黃鞣質(zhì)對(duì)SD大鼠創(chuàng)傷性腦損傷繼發(fā)腦水腫的抑制作用并探討其作用機(jī)制。方法采用Feeney自由落體墜擊法制備大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，腹腔注射大黃鞣質(zhì)，測(cè)定給藥后大鼠腦組織含水量、血管通透性及SOD水平的變化，采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定大鼠腦組織AQP4和GFAP表達(dá)的變化。結(jié)果與模型組相比，給藥組大鼠腦組織含水量顯著下降（P＜0.05），腦組織SOD水平顯著提高（P＜0.05），血管通透性明顯下降（P＜0.05）；免疫組化法檢測(cè)給藥組大鼠AQP4和GFAP的陽性細(xì)胞數(shù)減少，顏色變淺，陽性細(xì)胞表達(dá)評(píng)分明顯低于模型組各亞組（P＜0.01）；蛋白印跡免疫試驗(yàn)法檢測(cè)給藥組AQP4和GFAP的陽性表達(dá)下降，其表達(dá)量與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論大黃鞣質(zhì)對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷繼發(fā)腦水腫的抑制作用與降低血管通透性、增加SOD水平和降低水通道蛋白AQP4和GFAP的表達(dá)有關(guān)。

大黃鞣質(zhì) 腦損傷 腦水腫 抑制作用

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的常見疾病，該病致死、致殘率高，是外傷性死亡的首要原因［1］。創(chuàng)傷性腦水腫是創(chuàng)傷性腦損傷的繼發(fā)癥，主要包括血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫兩種類型，是創(chuàng)傷性腦損傷后的一種病理、生理反應(yīng)，抑制腦創(chuàng)傷后繼發(fā)的腦組織水腫是降低腦創(chuàng)傷危險(xiǎn)因素的關(guān)鍵。鞣質(zhì)是存在于植物體內(nèi)的多酚類化合物，可有效清除體內(nèi)自由基，防止脂質(zhì)氧化對(duì)機(jī)體造成的損傷，能與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀，表現(xiàn)出良好的收斂作用。鞣質(zhì)是大黃的重要活性成分，大黃鞣質(zhì)在大黃生藥材中含量達(dá)30%，其單體成分主要包括沒食子酸（gallic acid）和d-兒茶素（d-catechin）［2］。研究顯示，大黃鞣質(zhì)具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、抗過敏及止血收斂等多種作用［3］，但大黃鞣質(zhì)用于減輕創(chuàng)傷性腦水腫的研究鮮有報(bào)道。本文系統(tǒng)報(bào)道了大黃鞣質(zhì)單體沒食子酸、d-兒茶素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為大黃鞣質(zhì)在創(chuàng)傷性腦損傷中的應(yīng)用研究提供參考。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠120只 （由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK2014-0003），6～8周齡，體質(zhì)量220～250 g。

1.2 藥物與試劑 沒食子酸（純度＞98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）；d-兒茶素（純度＞98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）；Evans Blue（北京索萊）；蘇木素染色液（北京賽馳生物科技有限公司）；甲醛（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯甲基磺酰氟（分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 模型制備 采用Feeney自由落體法制作大鼠腦損傷模型，SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/ 100 g，麻醉后將大鼠俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，在左側(cè)顱腦實(shí)施開顱手術(shù)，行頭部正中縱行切口，剝離骨膜，暴露前囟和矢狀縫；在大鼠前囟后方1.5 mm，中線右側(cè)2.5 mm處鉆一直徑為5 mm的骨洞，保持硬腦膜完整；將自由落體裝置底座置于右頂部骨窗的硬腦膜表面，20 g砝碼從30 cm高處自由墜落至金屬圓柱體表面，擊中打擊棒，下陷深度為0.25 cm，致大鼠中度腦損傷。用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，即得大鼠腦創(chuàng)傷模型。假手術(shù)模型只開顱、手術(shù)、縫合，不做墜擊創(chuàng)傷。

1.4 分組與給藥 將120只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和給藥組，每組以腦損傷后時(shí)間點(diǎn)再隨機(jī)分為12、24、48 h和72 h 4個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只。假手術(shù)組、模型組腹腔注射生理鹽水10 mL/（kg·24 h），給藥組于創(chuàng)傷模型制備完成后立即腹腔注射含沒食子酸和d-兒茶素的生理鹽水溶液10 mL/（kg·24 h），相當(dāng)于給藥沒食子酸和d-兒茶素劑量100 mg/（kg·24 h）。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) （1）對(duì)腦組織含水量的影響。分別于給藥后12、24、48、72 h，開顱取損傷側(cè)大腦半球，準(zhǔn)確稱取濕重后，置于100～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重，稱取質(zhì)量，記錄干重，以假手術(shù)組、模型組為對(duì)照，比較給藥后腦組織含水量的變化。按下式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量 （%）=（濕重-干重）／濕重× 100%。（2）對(duì)腦血管通透性的影響。伊文氏藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取伊文氏藍(lán)8 mg，采用生理鹽水定容至50 mL，分別取適當(dāng)體積的伊文氏藍(lán)加至甲酰胺溶液中，質(zhì)量濃度分別為10、8、4、2、1 μg/mL，60℃孵育24 h，設(shè)定檢測(cè)波長632 nm，測(cè)定A值，計(jì)算線性回歸方程，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，線性回歸，得方程y=0.123x+0.015，r=0.9998，在1～10 μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸收度值線性關(guān)系良好。于取樣點(diǎn)前2 h經(jīng)股靜脈緩慢注入2.5%伊文氏藍(lán) （EB，0.2 mL/ 100 g），麻醉大鼠，分別于給藥12、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，開胸經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管，生理鹽水快速?zèng)_凈血液后斷頭取腦，取損傷側(cè)大腦半球腦組織，浸泡在甲酰胺溶液中，60℃避光水浴24 h，取出組織，浸出液4000 r/min離心30 min，取上清液，按上述方法測(cè)定吸收值，計(jì)算EB含量（μg/g濕重腦組織），以假手術(shù)組、模型組為對(duì)照，比較給藥后腦血管通透性的變化。（3）對(duì)腦組織超氧化物歧化酶（SOD）水平的影響。分別于給藥12、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，斷頭處死大鼠，取損傷側(cè)大腦半球皮層組織100 mg。置于9.9 mL pH7.4的PBS液中，高速勻漿后，20000 r/min離心10 min，取上清液5 μL，按試劑盒法測(cè)定SOD活性［4］。（4）對(duì)腦組織AQP4和GFAP表達(dá)的影響。采用IHC檢測(cè)腦組織AQP4和GFAP的表達(dá)［5］，根據(jù)腦組織細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞判斷為AQP4或GFAP表達(dá)陽性細(xì)胞。對(duì)各組AQP4表達(dá)評(píng)分，先按陽性細(xì)胞比例將0～1%、1%～10%、10%～50%、50%～80%、80%～100%分別記為0、1、2、3、4分；再按染色強(qiáng)度將無、弱、中、強(qiáng)分別記為0、1、2、3分，將兩者得分相乘后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)，分別以AQP4和GFAP和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的積分吸光度（A）值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腦組織水含量比較 見表1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h的腦組織水含量均顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組大鼠的腦組織水含量均顯著下降（P＜0.05），與假手術(shù)組相當(dāng)。

表1 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織水含量比較（%，±s）

表1 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織水含量比較（%，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手術(shù)組 1 0模型組 1 0 7 7 . 9 3 ± 0 . 1 8 7 7 . 9 8 ± 0 . 2 0 7 7 . 9 0 ± 0 . 4 1 7 7 . 6 4 ± 0 . 5 1 8 0 . 4 9 ± 0 . 4 9*8 1 . 5 1 ± 0 . 6 0*8 0 . 3 6 ± 0 . 6 2*7 8 . 7 1 ± 0 . 4 1*給藥組 1 0 7 8 . 3 9 ± 0 . 5 7△7 9 . 8 7 ± 0 . 4 3△7 8 . 9 4 ± 0 . 4 8△7 7 . 9 3 ± 0 . 6 7△

2.2 各組腦血管通透性比較 見表2。模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h的腦血管通透性與假手術(shù)組相比均顯著上升（P＜0.01）；給藥組腦血管通透性與模型組相比顯著下降（P＜0.05），與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠對(duì)腦血管通透性比較（μg/g，±s）

表2 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠對(duì)腦血管通透性比較（μg/g，±s）

組別 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手術(shù)組 1 0模型組 1 0 2 . 7 2 ± 0 . 7 3 2 . 7 1 ± 0 . 6 9 2 . 7 2 ± 0 . 7 1 2 . 7 1 ± 0 . 7 2 6 . 1 0 ± 0 . 6 8**6 . 0 9 ± 0 . 6 7**6 . 1 1 ± 0 . 6 7**6 . 1 0 ± 0 . 6 6**給藥組 1 0 4 . 1 2 ± 0 . 3 1△4 . 1 1 ± 0 . 3 0△4 . 1 3 ± 0 . 2 9△4 . 1 2 ± 0 . 3 2△

2.3 各組腦組織SOD水平比較 見表3。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h的SOD水平顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，給藥組大鼠的SOD水平顯著上升（P＜0.01），與假手術(shù)組相當(dāng)。

表3 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織SOD水平比較（U/mg，±s）

表3 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織SOD水平比較（U/mg，±s）

組別 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手術(shù)組 1 0模型組 1 0 1 2 7 . 2 2 ± 0 . 3 2 1 2 7 . 3 1 ± 0 . 3 4 1 2 7 . 2 4 ± 0 . 3 1 1 2 7 . 3 1 ± 0 . 2 9 1 0 1 . 1 4 ± 0 . 4 1**1 0 2 . 2 1 ± 0 . 2 7**1 0 1 . 5 6 ± 0 . 3 6**1 0 3 . 5 3 ± 0 . 4 3**給藥組 1 0 1 2 3 . 2 7 ± 0 . 3 7△△1 2 4 . 3 2 ± 0 . 3 9△△1 2 3 . 4 9 ± 0 . 2 7△△1 2 3 . 5 8 ± 0 . 2 9△△

圖1 各組大鼠腦組織AQP4陽性細(xì)胞表達(dá)

圖2 各組大鼠腦組織GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)

表4 各組大鼠腦組織AQP4和GFAP的表達(dá)比較（分，±s）

表4 各組大鼠腦組織AQP4和GFAP的表達(dá)比較（分，±s）

1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h 2 . 3 3 ± 0 . 2 2 4 . 2 8 ± 0 . 5 3 3 . 9 9 ± 0 . 1 9 3 . 8 7 ± 0 . 5 7 3 . 2 1 ± 0 . 1 1 5 . 0 0 ± 0 . 8 2 4 . 9 8 ± 0 . 3 9 4 . 5 3 ± 0 . 6 2 3 . 3 4 ± 1 . 2 1*6 . 5 8 ± 1 . 3 2*6 . 3 7 ± 1 . 1 9*5 . 7 8 ± 1 . 5 3*（n = 1 0） G F A P 4 . 8 3 ± 1 . 2 9**7 . 8 1 ± 1 . 7 5**7 . 1 7 ± 1 . 7 6**6 . 7 3 ± 1 . 6 1**給藥組 A Q P 4 2 . 5 6 ± 0 . 4 7△4 . 5 1 ± 0 . 5 2△4 . 1 3 ± 0 . 4 1△4 . 1 1 ± 0 . 3 5△（n = 1 0） G F A P 3 . 3 7 ± 0 . 2 6△△5 . 9 2 ± 0 . 7 1△△5 . 2 7 ± 0 . 6 5△△4 . 9 8 ± 0 . 7 3△△組別 指標(biāo)假手術(shù)組 A Q P 4（n = 1 0） G F A P模型組 A Q P 4

圖3 各組大鼠腦組織AQP4水平

圖4 各組腦組織GFAP水平WB測(cè)定結(jié)果

2.4 各組腦組織AQP4和GFAP表達(dá)比較 （1）免疫組化法。見圖1～2，表4。細(xì)胞核或胞質(zhì)中存在棕黃色或棕褐色顆粒為AQP4和GFAP陽性細(xì)胞。與假陽性組相比，模型組大鼠腦損傷后12、24、48、72 h可見大量AQP4和GFAP陽性細(xì)胞，且染色較深；給藥組在腦損傷后12、24、48、72 h可見AQP4和GFAP陽性細(xì)胞，數(shù)量較模型組相應(yīng)時(shí)間段減少，且顏色稍淺，而假手術(shù)組腦組織中僅可見少量散在的AQP4和GFAP陽性細(xì)胞。模型組各相應(yīng)時(shí)間段AQP4和GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)評(píng)分高于假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組各相應(yīng)時(shí)間段腦組織中AQP4和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)減少，陽性細(xì)胞表達(dá)IHC評(píng)分明顯低于模型組各相應(yīng)時(shí)間段（P＜0.01）。（2）蛋白質(zhì)免疫印跡法。見圖3～4，表5。假手術(shù)組僅見少量散在的AQP4和GFAP陽性細(xì)胞，與假手術(shù)組相比，模型組可見大量的AQP4和 GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)，與模型組相比，給藥組AQP4和GFAP的陽性表達(dá)下降。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間段腦組織AQP4和GFAP表達(dá)量明顯增加 （P＜0.01），表明造模成功，給藥組各時(shí)間段腦組織AQP4和GFAP表達(dá)量下降，與模型組對(duì)應(yīng)各時(shí)間段相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表5 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織AQP4、GFAP表達(dá)水平比較（±s）

表5 各組創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織AQP4、GFAP表達(dá)水平比較（±s）

1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h 0 . 4 2 ± 0 . 0 5 0 . 4 3 ± 0 . 0 4 0 . 4 1 ± 0 . 0 6 0 . 4 2 ± 0 . 0 5 0 . 6 2 ± 0 . 0 3 0 . 6 3 ± 0 . 0 4 0 . 6 1 ± 0 . 0 3 0 . 6 2 ± 0 . 0 4 0 . 8 6 ± 0 . 0 8**1 . 4 3 ± 0 . 0 7**1 . 2 4 ± 0 . 0 8**1 . 0 6 ± 0 . 0 5**（n = 1 0） G F A P 1 . 0 2 ± 0 . 0 5**1 . 4 7 ± 0 . 0 6**1 . 2 9 ± 0 . 0 7**1 . 0 8 ± 0 . 0 5**給藥組 A Q P 4 0 . 6 3 ± 0 . 0 5△△1 . 1 4 ± 0 . 0 4△△0 . 9 6 ± 0 . 0 7△△0 . 7 1 ± 0 . 0 6△△（n = 1 0） G F A P 0 . 8 4 ± 0 . 0 4△△1 . 2 1 ± 0 . 0 3△△1 . 0 6 ± 0 . 0 4△△0 . 8 9 ± 0 . 0 7△△組別 指標(biāo)假手術(shù)組 A Q P 4（n = 1 0） G F A P模型組 A Q P 4

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為腦損傷的主要病機(jī)是腦髓損傷，清竅阻閉，其治療應(yīng)以逐瘀通腑為原則，故泄下類中藥在腦損傷中的應(yīng)用較多。大黃是泄下類中藥的代表藥物。腦損傷后繼發(fā)的腦水腫是臨床常見的危險(xiǎn)因素，腦損傷后氧自由基急劇增加，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜磷脂和蛋白質(zhì)的氧化，可直接損傷神經(jīng)細(xì)胞，加重?fù)p傷的程度，故自由基蓄積與二次損傷過程密切相關(guān)。大黃鞣質(zhì)富含酚羥基，具有很強(qiáng)的供氫能力，能有效清除體內(nèi)自由基。本研究表明大黃鞣質(zhì)可提高體內(nèi)SOD水平，抑制炎性因子的釋放，減輕腦水腫造成的二次損傷。大黃鞣質(zhì)具有明顯的收斂作用，研究發(fā)現(xiàn)，大黃鞣質(zhì)在腦損傷早期即可拮抗腦水腫，并且對(duì)腦水腫有長時(shí)間緩解作用；血管源性腦水腫是繼發(fā)性腦損傷的重要因素，本研究表明，大黃鞣質(zhì)可降低損傷組織腦血管通透性，抑制腦水腫的程度，這可能是大黃鞣質(zhì)對(duì)腦損傷保護(hù)作用的機(jī)制之一。

AQP4在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，其含量與腦水腫的程度亦呈現(xiàn)正相關(guān)性［7］。腦損傷后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞膨脹，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞的膨脹，是導(dǎo)致腦水腫的直接原因［8］，研究證實(shí)AQP4與GFAP在損傷腦組織中共同存在［9］。本研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后72 h內(nèi)AQP4表達(dá)水平顯著上升，大黃鞣質(zhì)給藥后可顯著降低其表達(dá)，表明大黃鞣質(zhì)可減輕腦組織水腫程度。GFAP具有維持星形細(xì)胞形態(tài)和功能的作用，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)志物，血清中濃度上升水平與創(chuàng)傷性腦損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［10］，本研究顯示大黃鞣質(zhì)可以顯著降低腦損傷后GFAP蛋白表達(dá)水平，可緩解腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹的程度。

本研究已表明大黃鞣質(zhì)可提高SOD水平，降低大鼠損傷腦組織水含量、腦血管通透性及AQP4和GFAP的表達(dá)，從而對(duì)損傷腦組織起到較好的保護(hù)作用，大黃鞣質(zhì)對(duì)腦損傷繼發(fā)的肺損傷、應(yīng)激性高血糖的保護(hù)機(jī)制及其臨床應(yīng)用效果有待進(jìn)一步研究。

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Study of Rhubarb Tannins Effect on Acute Encephaledema by Rats with Encephaledema Followed by Traumatic Brain Injury

ZHANG Bo1，2，3，WANG Bing2，WANG Yongqiang2，et al.1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2 Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China；3 Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300060，China

Objective：To observe the influence of Rhubarb tannins on encephaledema followed by traumatic brain injury in SD rats.Methods：In order to prepare of traumatic brain injury model，the classic Feeney free fall drop was used to wounded rats.Rhubarb tannins were given rats by intraperitoneal injection.The brain of rat water content，cerebral vascular permeability，SOD level，cell AQP4 and GFAP expression using immune histochemical method and protein determination of western blot test were determination.Results：The brain of rat water content and the cerebral vascular permeability in the Rhubarb tannins group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05）.The SOD level in Rhubarb tannins group was higher obviously than that in the model group（P＜0.05）.The AQP4 and the GFAP in Rhubarb tannins group were decreased remarkably.There were some statistical differences between the Rhubarb tannins group and the model group（P＜0.05）.Conclusion：Rhubarb tannins can cure encephaledema in rats followed by traumatic brain injury.Its mechanism is through reduction of cell AQP4 and GFAP expression，decrease of cerebral vascular permeability and increase of SOD level to achieve protective effect of encephaledema.

Rhubarb tannins；Brain injury；Encephaledema；Inhibition

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0380-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.002

2014-12-13）

衛(wèi)生部國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目

△通信作者（電子郵箱：zhangbdr@126.com）