孫 燕張愛琴郜飛宇

（1.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇 無錫214023）

·研究報(bào)告·

芍藥軟肝合劑對(duì)荷H22肝癌小鼠免疫功能及VEGF、PCNA表達(dá)的影響*

孫 燕1張愛琴1郜飛宇2

（1.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇 無錫214023）

目的觀察芍藥軟肝合劑對(duì)H22肝癌小鼠免疫功能的影響，并初步探討芍藥軟肝合劑對(duì)及VEGF、PCNA表達(dá)的影響。方法采用細(xì)胞接種的方法建立小鼠H22肝癌動(dòng)物模型，隨機(jī)分為正常組、模型組、環(huán)磷酰胺組、中藥低、中、高劑量組，觀察各組動(dòng)物的整體情況，行免疫組化染色實(shí)驗(yàn)對(duì)腫瘤組織中VEGF、PCNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果1）成功建立小鼠H22肝癌動(dòng)物模型；2）芍藥軟肝合劑提高荷瘤小鼠機(jī)體免疫功能；3）芍藥軟肝合劑能降低H22肝癌小鼠腫瘤組織中VEGF、PCNA的表達(dá)水平。結(jié)論芍藥軟肝合劑對(duì)H22荷瘤小鼠的胸腺、脾臟有保護(hù)作用，能提高荷瘤小鼠機(jī)體免疫功能。其能抑制荷瘤小鼠中VEGF、PCNA蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤生長。

芍藥軟肝合劑 肝癌 免疫功能 VEGF PCNA

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一［1］，除傳統(tǒng)手術(shù)切除及放、化療等治療方法外，中醫(yī)中藥治療在肝癌的治療中也發(fā)揮了重要的作用。芍藥軟肝合劑是浙江省腫瘤醫(yī)院研制開發(fā)的中藥內(nèi)服制劑，具有解毒、止痛、消腫等功效，主要用于肝癌、肝硬化的輔助治療，特別是對(duì)原發(fā)性肝癌有較好的療效［2］，臨床及實(shí)驗(yàn)研究均表明該方有較好的抗肝纖維化的作用，可改善肝臟血液循環(huán)，恢復(fù)肝細(xì)胞功能。本研究采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)、分子生物學(xué)等方法，研究中藥組方芍藥軟肝合劑對(duì)H22肝癌移植瘤小鼠免疫功能及腫瘤組織中VEGF、PCNA指標(biāo)表達(dá)的影響，以期闡明芍藥軟肝合劑在肝癌治療中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及瘤株 ICR小鼠72只，均4~6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，購買并飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房。小鼠H22肝癌瘤株，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物 芍藥軟肝合劑由白芍、白花蛇舌草、半枝蓮、重樓、三葉青、雞內(nèi)金、青皮、陳皮、山楂、郁金、三棱、莪術(shù)、白茅根、焦梔子、金錢草、紫金牛、白毛藤、路路通、仙鶴草等多味中藥組成，成人用量每日3次，每次30 mL，按《中藥藥理研究方法學(xué)》中折算小鼠低、中、高用量相應(yīng)的芍藥軟肝合劑用量分別為0.2、0.4、0.8 mL，置4℃冰箱備用。注射用環(huán)磷酰胺（CTX）：200 mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)08091432；用滅菌生理鹽水配制成2 mg/mL的稀釋液，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

1.3 試劑 兔抗鼠VEGF單抗購自杭州達(dá)誠生物技術(shù)公司，Santa Cruz公司產(chǎn)品。PCNA鼠抗多克隆抗體：購自杭州達(dá)誠生物技術(shù)公司，Santa Cruz公司產(chǎn)品?？贵w稀釋液：博士德生物工程有限公司。SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒及DAB顯色盒均購自杭州達(dá)誠生物技術(shù)公司。

1.4 模型制備 取H22肝癌細(xì)胞株，接種于小鼠腹腔，待7 d后，選擇其腹水飽滿小鼠，在超凈臺(tái)內(nèi)于無菌條件下消毒鼠腹，抽取適量的乳白色腹水，用生理鹽水稀釋，配制成1×107/mL瘤細(xì)胞懸液，以每只0.2 mL將瘤細(xì)胞懸液接種于ICR小鼠右腋皮下，復(fù)制小鼠H22肝癌模型，整個(gè)操作過程控制在2 h之內(nèi)，以保持瘤細(xì)胞的活性。

1.5 分組與方法 于接種后第2天（造模24 h后），將小鼠分為6組，每組12只，各組在給藥在造模后第2天至第15天。正常組不作任何處理；模型組予生理鹽水0.4mL灌胃，每日1次；環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺注射液，劑量為20 mg/kg，腹腔注射，每日1次；中藥低劑量組予芍藥軟肝合劑0.2 mL，灌胃，每日1次；中藥中劑量組予芍藥軟肝合劑0.4 mL，灌胃，每日1次；中藥高劑量組予芍藥軟肝合劑0.8 mL，灌胃，每日1次。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 在停藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠；取出瘤組織、脾、胸腺等組織，分析天平稱重脾、胸腺。脾指數(shù)=脾質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；取部分瘤組織瘤組織置于10%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水后行石蠟包埋，常規(guī)切片，分別行VEGF、PCNA的免疫組化染色，結(jié)果檢測(cè)于400倍光鏡下觀察每張切片中VEGF、PCNA的表達(dá)情況，選取著色最明顯的視野予以采集圖像，利用圖像分析軟件測(cè)其累積光密度值（IOD值），取積分光密度值大小表示染色強(qiáng)度，其數(shù)值越大表示陽性染色越強(qiáng)，其數(shù)值越小表示陽性染色越弱。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示；多組間資料比較采用方差分析，結(jié)果之間多樣本比較用F檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組荷H22肝癌小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)比較 見表1。1）胸腺指數(shù)：與正常組比較，余5組胸腺指數(shù)均減小，模型組、環(huán)磷酰胺組、中藥低劑量組、中藥高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥中劑量組的胸腺指數(shù)較大，有非常顯著性差異 （P＜0.01）。2）脾指數(shù)：與正常組比較，余五組脾指數(shù)均減?。≒＜0.05），與模型組比較，中藥中劑量組的脾指數(shù)增大（P＜0.01），中藥各劑量組中，以中藥中劑量組效果最明顯。

表1 各組荷H22肝癌小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)比較（±s）

表1 各組荷H22肝癌小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n 胸腺指數(shù) 脾指數(shù)正常組 1 2 2 . 3 3 ± 0 . 4 7 8 . 6 0 ± 0 . 7 4模型組 1 1 1 . 6 1 ± 0 . 2 1**5 . 6 2 ± 2 . 4 1**環(huán)磷酰胺組 8 1 . 7 2 ± 0 . 4 7**5 . 8 9 ± 1 . 6 6**中藥低劑量組 9 1 . 9 2 ± 0 . 2 9*△6 . 1 2 ± 4 . 2 4*△中藥中劑量組 1 1 2 . 2 3 ± 0 . 4 4△△7 . 5 6 ± 3 . 9 3*△△中藥高劑量組 1 0 1 . 8 9 ± 0 . 3 8*△6 . 3 1 ± 4 . 7 3*△

2.2 各組荷H22肝癌小鼠腫瘤組織VEGF表達(dá)比較見表2。鏡下可見，VEGF陽性表達(dá)見于癌細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)，棕黃色，呈灶性分布。結(jié)果表明，與模型組相比，環(huán)磷酰胺組及中藥各劑量組的VEGF表達(dá)水平均有所降低（P＜0.05），其中環(huán)磷酰胺組及中藥中劑量組下降最為明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），但中藥中劑量組與環(huán)磷酰胺組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中藥低劑量組及高劑量組與環(huán)磷酰胺組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組荷H22肝癌小鼠腫瘤組織VEGF表達(dá)比較（±s）

表2 各組荷H22肝癌小鼠腫瘤組織VEGF表達(dá)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n I O D值模型組 1 1 4 0 6 6 7 8 . 2 5 ± 3 5 5 7 3 . 2 3環(huán)磷酰胺組 8 2 9 5 1 9 3 . 4 0 ± 3 8 1 0 5 . 6 6**中藥低劑量組 9 3 6 7 4 8 9 . 9 3 ± 8 7 8 9 5 . 9 7*△中藥中劑量組 1 1 3 2 2 9 7 9 . 8 0 ± 5 8 3 2 2 . 4 3**中藥高劑量組 1 0 3 5 0 8 7 7 . 7 8 ± 2 7 4 4 0 . 9 6*△

2.3 各組荷H22肝癌小鼠腫瘤組織PCNA表達(dá)比較見表3。鏡下PCNA陽性表達(dá)為細(xì)胞核膜周圍及核內(nèi)被染成棕黃色，呈顆粒狀或者彌漫樣。單因素方差分析表明，與模型組相比，環(huán)磷酰胺組及中藥各劑量組的PCNA表達(dá)水平均有所降低，除中藥低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其他均都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中環(huán)磷酰胺組及中藥中劑量組降低最為明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。與環(huán)磷酰胺組相比，中藥中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中藥低劑量組及中藥高劑量組與環(huán)磷酰胺組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組荷H22肝癌小鼠腫瘤組織PCNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組荷H22肝癌小鼠腫瘤組織PCNA表達(dá)比較（±s）

組別 n I O D值模型組 1 1 3 1 3 8 7 8 . 2 4 ± 3 0 6 8 4 . 1 6環(huán)磷酰胺組 8 2 4 4 8 5 4 . 7 6 ± 1 5 1 6 5 . 0 8**中藥低劑量組 9 3 0 6 2 4 1 . 9 6 ± 8 7 1 9 3 . 9 7△△中藥中劑量組 1 1 2 5 3 7 1 8 . 8 1 ± 2 9 4 3 8 . 1 8**中藥高劑量組 1 0 2 7 1 4 6 7 . 2 3 ± 3 2 4 5 9 . 9 6*△

3 討 論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，肝癌大致屬于中醫(yī)學(xué)“肝積”、“肥氣”、“肝著”、“積聚”、“癥瘕”、“鼓脹”等范疇。本院院內(nèi)制劑芍藥軟肝合劑方中炒白芍柔肝以順其性，白花蛇舌草、半枝蓮、三葉青、白毛藤、重樓清熱解毒、消腫散結(jié)兼以內(nèi)清相火，白茅根、金錢草消腫利尿，三棱、莪術(shù)具有行氣破血、祛瘀消積等功能，郁金佐白芍，可起行氣解郁、柔肝利膽功效，陳皮、青皮理氣降逆、調(diào)暢氣機(jī)，焦山楂、雞內(nèi)金消積滯、健脾胃，此方切合肝癌氣滯血瘀、痰凝、毒聚相互交結(jié)的病理變化［3］，且符合肝為剛臟，內(nèi)藏相火，體陰而用陽的肝臟中醫(yī)生理特性。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體的免疫功能下調(diào)或失控密切相關(guān)。胸腺和脾臟是機(jī)體極其重要的免疫器官，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小可以直接反映機(jī)體免疫水平的高低［4-5］，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為在惡性腫瘤防治過程中，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能是疾病治療的一個(gè)重要策略［6］，所以本實(shí)驗(yàn)觀察各組用藥后對(duì)移植瘤小鼠脾臟和胸腺的影響，具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明芍藥軟肝合劑對(duì)H22肝癌小鼠的免疫器官有一定的保護(hù)作用，以中劑量組效果最好。芍藥軟肝合劑可能是通過增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能，調(diào)控機(jī)體的防御機(jī)制，從而起到抑制腫瘤生長的作用。

另外，為了證實(shí)芍藥軟肝合劑的抗癌機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了荷H22小鼠的VEGF和PCNA的表達(dá)情況。VEGF是最有效的促血管生成促進(jìn)因子，目前有研究表明抗腫瘤的機(jī)制之一主要就是通過阻斷血管內(nèi)皮生長因子及其主要受體（VEGFR）來達(dá)到抑制腫瘤新生血管形成［7］。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果均表明，VEGF及其受體在肝癌組織中較正常肝組織呈過高表達(dá)，并且肝癌細(xì)胞的VEGF表達(dá)程度還與患者的預(yù)后 （尤其是生存期）密切相關(guān)［8-9］。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）又稱周期素，主要存在于增殖細(xì)胞核中，在DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，其量的變化可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)良好指標(biāo)。王東等［10］應(yīng)用免疫組化檢測(cè)了80例手術(shù)切除HCC組織PCNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織PCNA表達(dá)較高，且表達(dá)水平與肝癌大小、組織學(xué)分級(jí)、核分裂相計(jì)數(shù)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也證實(shí)了PCNA可能是反映肝癌侵襲能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測(cè)可見，模型組中VEGF及PCNA表達(dá)最多，用藥組VEGF及PCNA表達(dá)明顯減少，其中環(huán)磷酰胺組與中藥中劑量組效果最為顯著 （與模型組比較P＜0.01）。提示芍藥軟肝合劑可減少小鼠肝癌移植瘤VEGF及PCNA的表達(dá)，說明芍藥軟肝合劑在一定程度上能夠抑制肝癌新生血管生成和腫瘤細(xì)胞活性，從而抑制了腫瘤細(xì)胞增殖。

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Immune Effect of Shaoyao Ruangan Recipe on Hepatocarcinoma in Tumor-bearing H22 mice and Its Ef-fect on VEGF and PCNA Expression

SUN Yan，ZHANG Aiqin，GAO Feiyu.Zhejing Cancer Hospital，Zhejing，Hangzhou 310022，China

Objective：To observe the immune effec of Shaoyao Ruangan Recipe on hepatocarcinoma H22 tumor-bearing mice and to preliminary discuss the express influence of Shaoyao Ruangan Recipe to Proteins such as VEGF、PCNA and In order to clarify the Mechanism of Hepatocellular Carcinoma with Shaoyao Ruangan Recipe.Methods：Animal models of H22 hepatic cancer with mice were built according to inoculate tumor cell. Mice were randomly divided into six groups such as the normal group，the model group，CTX group，low-dose，middle-dose and high-dose group of Shaoyao Ruangan Recipe.Observe the mices'overall condition.The tumor growth inhibition rate spleen index was determined separately.The tumor tissue were carried out by the immune dyeing experiment to determine the protein express of VEGF、PCNA in the tumor tissue.Results：1）The animal model of Hepatocarcinoma H22 Tumor-bearing Mice was set up successfully.2）Shaoyao Ruangan Recipe could improve the immunity of tumor-bearing mice.3）The middle-dose of Shaoyao Ruangan Recipe could reduce the expression of VEGF and PCNA.Conclusions：Shaoyao Ruangan Recipe can protect the spleen and thymus gland of tumor-bearing mice，also has the ability to increase the immunity of tumor-bearing micec.Its anti-tumor mechanism may relate to the control of VEGF、PCNA express in tumor-bearing mice.

Shaoyao Ruangan Recipe；Hepatic carcinoma；Immunity；VEGF、PCNA

R285.5

A

1004-745X（2015）04-0590-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.008

2015-02-11）

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010ZA007）