臧文娟，李艷琴,*，李彬春，郭俊杰，趙玉立

糖尿病患者腸道中4 種重要菌群的定量分析

臧文娟1，李艷琴1,*，李彬春1，郭俊杰2，趙玉立2

（1.山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012）

目的：了解正常人群與Ⅱ型糖尿病人，以及Ⅱ型糖尿病人在是否有家族遺傳、是否用藥治療和是否伴隨肥胖等情況下腸道中擬桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌和乳桿菌的含量與變化，為預防和治療Ⅱ型糖尿病開辟新途徑。方法：收集上述各類人群糞便樣品（每組10人），分別提取樣品中微生物的總DNA，運用熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增4種重要菌群的特異性片段，計算含量，分析上述菌群的變化差異。結(jié)果：正常人群腸道中的擬桿菌和雙歧桿菌含量均顯著低于Ⅱ型糖尿病人群；柔嫩梭菌和乳桿菌含量均顯著高于后者。在Ⅱ型糖尿病人群中，用藥患者組和肥胖+高血糖患者組的腸道中擬桿菌和雙歧桿菌含量均顯著低于未用藥患者組和單純高血糖患者組，而柔嫩梭菌和乳桿菌含量均顯著高于后者。有無Ⅱ型糖尿病遺傳史對患者腸道內(nèi)4種菌群的含量均無顯著影響。結(jié)論：4種重要菌群與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展有密切關系；用藥治療后的患者腸道中4種重要菌群含量比其他各組更接近正常人群；肥胖易加重Ⅱ型糖尿病病情；而有無Ⅱ型糖尿病家族遺傳對這4種菌群的含量幾乎沒有影響。

糖尿病患者；腸道菌群；定量分析；擬桿菌；雙歧桿菌；柔嫩梭菌；乳桿菌

隨著社會發(fā)展和人們生活方式的改變，糖尿病、肥胖等代謝性疾病迅速發(fā)展，據(jù)2011年中華糖尿病協(xié)會最新調(diào)查，中國糖尿病患者高達1億例，糖尿病及其慢性并發(fā)癥嚴重影響了人們的生活質(zhì)量，給社會及家庭帶來沉重的負擔，已成為全球突出的社會問題。人體腸道內(nèi)棲息著大約30個屬550多種細菌，其中僅雙歧桿菌和擬桿菌就占細菌總數(shù)90%以上[1]。腸道菌群約占正常成人糞便質(zhì)量的60%[2]。眾多的共生菌在腸道黏膜形成菌膜，對人體的營養(yǎng)代謝、合成機體必需的微量元素和維生素、免疫防御等方面起著不可替代的作用[3]。腸道菌群在體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，完全可稱得上是人體后天獲得的重要器官——微生物器官。Ⅱ型糖尿病的典型特征是糖代謝紊亂，而近些年腸道菌群對人體代謝的影響備受關注，有研究表明雙歧桿菌和乳桿菌等益生菌與宿主間在炎癥反應、調(diào)節(jié)能量平衡方面有著密切關系[4]，因此人們推測乳桿菌和雙歧桿菌是控制體質(zhì)量及能量代謝的一個重要因素，且與Ⅱ型糖尿病、肥胖等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。有研究也進一步證明了Ⅱ型糖尿病人腸道中乳桿菌種類和數(shù)量低于正常人群[6]。擬桿菌，尤其是多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）能合成多種糖基水解酶，降解抗性淀粉[7]，還能調(diào)控腸上皮細胞的炎癥反應[8]。梭菌亞群的組成中有一類為丁酸鹽產(chǎn)生菌，丁酸鹽被認為具有保護腸道抵御結(jié)腸癌的作用[9]。由于腸道微生物種類多、數(shù)量大、群落結(jié)構復雜，通常腸道菌群的定量分析多集中于4類與人體健康相關的特定菌群：擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌亞群（Clostridia leptumsubgroup）、雙歧桿菌屬（Bifidobacteria）和乳桿菌（Lactobacillus）[10-12]。本研究試圖通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[13]對健康個體和Ⅱ型糖尿病患者，以及Ⅱ型糖尿病人在是否有家族遺傳、是否用藥治療和是否伴隨肥胖等情況下糞便中的擬桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌及乳桿菌進行定量分析，比較各種Ⅱ型糖尿病患者與健康個體腸道中這4種菌群的差異，希望為以腸道菌群為靶點研究開發(fā)新的Ⅱ型糖尿病防治方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

Ⅱ型糖尿病病例納入標準：符合世界衛(wèi)生組織專家咨詢報告（WHO/NCD/NCS/99.2）糖尿病診斷標準[14]；無腫瘤及肝、腎等臟器嚴重損害；無甲狀腺等其他內(nèi)分泌疾病；近4周內(nèi)無腹瀉病或其他胃腸道疾病史；排除標本留取量不足或標本留取過程中有污染者。60例Ⅱ型糖尿病患者糞便標本取自2012年10月—2013年1月山西省中醫(yī)藥研究院內(nèi)分泌科患者，年齡（59±11）歲，彼此無血緣關系，經(jīng)檢測空腹血糖含量指標為（7.82±0.20）mmol/L；依據(jù)山西省中醫(yī)院檢驗報告單及入院時情況登記表將糖尿病患者分為6組：用藥患者組和未用藥患者組、有遺傳史患者組（父母一方或雙方有糖尿?。┖蜔o遺傳史患者組、肥胖+高血糖患者組（身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＞25 kg/m2）和單純高血糖患者組（BMI＜25 kg/m2），每組10人，男女各半。每組的病程、年齡、性別、血壓等基線資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。健康志愿者納入標準：無其他臟器嚴重損害、無甲狀腺功能異常等其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，身體健康；無糖尿??；采樣前1個月內(nèi)未服用過抗生素、微生態(tài)活菌制劑等；近4周內(nèi)無腹瀉病或其他胃腸道疾病史；無消化道慢性病史，常規(guī)體檢及糞便常規(guī)檢查均未見異常。同樣自2012年10月—2013年1月采集10例健康志愿者糞便標本，年齡（55±12）歲，經(jīng)檢測空腹血糖含量為（4.97±0.10）mmol/L。

1.2試劑與儀器

2×EasyTaqTMPCR SuperMix、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix北京TransGen Biotech公司；Loading Buffer、DNA Marker日本TaKaRa公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR引物由北京博邁德生物公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）純化。

ABI Step One PlusTMReal-Time PCR儀美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)英國UVItec公司；NanoDrop2000微量紫外分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司；漩渦振蕩器、電子天平上海精科公司；移液器德國Eppendorf公司；高速冷凍離心機長沙湘儀公司；PTC-200型PCR儀美國Bio-Rad公司；臺式微量離心機江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；低溫冰箱日本Sanyo公司。

1.3方法

1.3.1樣品的采集

新鮮糞便樣品均于研究對象排便后立即放入無菌EP管內(nèi)，0.5 h內(nèi)置于冰箱-20 ℃保存，3 d內(nèi)完成樣品內(nèi)細菌DNA的提取。

1.3.2各項生理生化指標的測定

對所有研究對象均測定晨起空腹時的體質(zhì)量、身高和各項血液指標。BMI為體質(zhì)量/身高2，單位為kg/m2。對研究對象靜脈取血樣，空腹血糖（glucose，GLU，隔夜空腹所測定的血糖值）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）含量等均采用相對應的試劑盒進行測定。

1.3.3腸道菌群總DNA的提取

將糞便樣品在冰上解凍，每例樣品稱取500 mg，運用苯酚-氯仿抽提法提取人體腸道內(nèi)菌群基因組總DNA[15]，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.4標準質(zhì)粒和標準曲線的制作

取正常人群腸道菌群基因組總DNA，分別用4種重要菌群特異性引物進行PCR擴增。25 ?L PCR反應體系：12.5μmol/L上下游引物各0.5 ?L、DNA模板20 ng、2×EasyTaqTMPCR SuperMix 12.5 ?L、ddH2O 10.5 ?L。PCR特異引物見表1，反應程序見表2。將以上4種菌群的PCR產(chǎn)物純化回收后分別作為目的DNA片段連接至pMDl8-T載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL10宿主細胞中，經(jīng)藍白斑篩選，得到陽性克隆后，提取質(zhì)粒DNA，酶切并經(jīng)PCR驗證。提取鑒定正確的質(zhì)粒，用微量紫外分光光度計測定其含量，ddH2O系列稀釋，作為標準品模板進行熒光定量PCR，繪制標準曲線。

表1 特異菌群的PCR引物序列Table 1 PCR primers of each specific group

表2 特異菌群的PCR反應程序Table 2 PCR program of each specific group

由于腸道微生物菌群的復雜性，該領域的研究者通常利用克隆文庫分析得到的各種菌群基因序列信息，針對特定菌群如擬桿菌屬[16]、柔嫩梭菌亞群[17]、乳酸菌[18]以及雙歧桿菌屬[19]等，設計了16S rRNA基因V區(qū)的特異引物，這些引物的特異性也被后續(xù)的研究所證實[20-21]。目前，表1中所列引物就如16S rDNA通用引物一樣，被廣泛認可和應用[10,22-24]。

1.3.5實時熒光定量PCR

將待測糞便中提取的DNA樣品分別進行4種菌群特異片段的實時熒光定量PCR，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒，在ABI Step One PlusTMReal-TimePCR儀上進行定量擴增，盡量在避光和低溫的條件下進行加樣操作。反應程序和特異引物同樣參照表1、2。用微量紫外分光光度計測定樣品的含量，將樣品的DNA含量稀釋至100 ng/?L。實時熒光定量PCR 20 ?L反應體系：12.5μmol/L上下游引物各0.8 ?L、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 ?L、質(zhì)?；驑悠稤NA 1μL、50×Passive Reference Dye 0.4 ?L，ddH2O 7 ?L。將各成分按上述體系加入八聯(lián)管中，每個樣品均同時設定3個平行復孔，每次反應均設標準質(zhì)粒為陽性對照和陰性對照（ddH2O代替DNA模板）。

由于各糞便樣品的含水量不同，再加上提取DNA環(huán)節(jié)中難以避免DNA部分損失，因此，本實驗采用某種菌群的lg（copies）/ng DNA來衡量其含量，而不是用lg（copies）/g糞便樣品。

1.4統(tǒng)計學處理

應用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件t檢驗進行數(shù)據(jù)處理，分析各項指標，比較目標菌群在各組中的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1正常人群和各類Ⅱ型糖尿病患者生理生化指標的比較分析

表3 各組人群血糖指標測定結(jié)果Table 3 Blood glucose indexes in subjects from each group

由表3可知，用藥患者組的GLU和HbA1c含量雖高于正常人群組，但已控制在正常人群參考范圍內(nèi)；另外5組患者的血糖指標均顯著高于正常人群參考范圍；尤其以未用藥患者組和肥胖+高血糖患者組的血糖指標最高，除有無遺傳史患者組外，其他情況互為相反的組間兩兩相比均有顯著差異。

由表4可知，各組人群的BMI和血脂指標測定結(jié)果與血糖指標測定結(jié)果基本一致，即用藥患者組的BMI和血脂指標雖區(qū)別于正常人群組，但已控制在正常人群參考范圍內(nèi)；另外5組患者的指標均顯著超出正常人群參考范圍；未用藥患者組和肥胖+高血糖患者組的血脂指標尤其不正常。由此可以看出，高血糖和高血脂，或糖尿病和肥胖有著密切的正相關性。

表4 各組人群體質(zhì)量指數(shù)和血脂指標測定結(jié)果Table 4 BMI and blood lipid indexes of subjects from each group

2.2 各菌群引物的特異性驗證及標準曲線

利用文獻[16-19]中提供的4種特異菌群引物對本實驗的樣品材料進行PCR擴增，結(jié)果得到長度正確的單一片段。沒有發(fā)現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，證明4種菌群特異引物適合本實驗。在此基礎上，將特異片段進行克隆、轉(zhuǎn)化。提取鑒定正確的質(zhì)粒，測定其含量，以ddH2O系列稀釋后作為標準品模板進行熒光定量PCR，以lg（copies）為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線，獲得4種菌群的線性回歸方程，其中擬桿菌為y=-3.397 3x+54.764（R2=1.000）；柔嫩梭菌為y=-3.897x+59.917（R2=0.990）；乳酸菌為y=-4.046 5x+61.788（R2=0.997）；雙歧桿菌為y=-3.598x+56.672（R2=0.998）。

2.3 PCR熔解曲線

圖1 4 種菌群的實時熒光定量PCR熔解曲線Fig.1 Real-time fluorescence quantitative PCR melting curve of four bacterial species

圖1為4種菌群的標準品（正常人群）和其他樣品的實時熒光定量PCR熔解曲線，通過分析標準品的熔解曲線，確定了擬桿菌、柔嫩梭菌、乳桿菌和雙歧桿菌的Tm值分別在83.67、86.2、86.35、83.97℃左右。4種菌群分別在對應的Tm值處有單峰，說明擴增產(chǎn)物正確，且沒有發(fā)現(xiàn)非特異產(chǎn)物，與熒光染料結(jié)合的為目的DNA片段。

2.4 PCR擴增曲線

擴增曲線是描述PCR動態(tài)進程的曲線，用于表示熒光強度與模板循環(huán)數(shù)的關系。由圖2可知，本實驗4種菌群的擴增曲線均呈光滑“S”形，分為基線期、對數(shù)期及平臺期3個階段，無異常擴增，說明4種菌群DNA擴增中采集的熒光信號數(shù)據(jù)準確。

圖2 特異菌群的實時熒光定量PCR擴增曲線Fig.2 Real-time fluorescence quantitative PCR amplification plots of specific bacteria

2.5特異菌群的定量檢測結(jié)果

圖3 各組菌群的定量比較結(jié)果Fig.3 Quantitative comparison of gut bacterial counts in subjects from each group

由圖3可知，各兩兩比較的組別中4種菌群含量差異表現(xiàn)出高度一致性，即：糖尿病患者組與正常人群組、未用藥患者組與用藥患者組4種菌群含量的差異均達到極顯著水平，肥胖+高血糖患者組與單純高血糖患者組之間的差異達到顯著水平，有遺傳史患者組與無遺傳史患者組之間無顯著差異。各種菌群的相對含量比較結(jié)果為：正常人群組的擬桿菌和雙歧桿菌含量均極顯著低于糖尿病患者組；柔嫩梭菌和乳桿菌含量均極顯著高于后者。在Ⅱ型糖尿病人群中，用藥患者組和肥胖+高血糖患者組擬桿菌和雙歧桿菌含量均顯著低于未用藥患者組和單純高血糖患者組，而柔嫩梭菌和乳桿菌含量均顯著高于后者。

3 討 論

目前許多學者認為，肥胖和Ⅱ型糖尿病不能只歸因于基因、戶外活動減少或營養(yǎng)習慣問題，腸道菌群也影響了宿主營養(yǎng)機制，與肥胖和Ⅱ型糖尿病密不可分。Cani等[25]研究認為，長期肥胖能引起腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin損壞，使內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)紊亂，進而改變腸道通透性；增加革蘭氏陰性菌群比例可導致其細胞壁成分脂多糖的分泌增加。與此同時，菌群比例失調(diào)會抑制腸道緊密連接蛋白ZO-1的表達，腸道上皮通透性增加，使得脂多糖不斷積累，由腸道進入血液循環(huán)，產(chǎn)生“代謝性內(nèi)毒素血癥”[26]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖能誘導全身性慢性炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展[27]。不斷積累的氧化應激和慢性炎癥可能引起胰島β細胞的凋亡，最終引起Ⅱ型糖尿病[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型糖尿病患者腸道中厚壁菌門數(shù)量下降[29]。近些年也有文獻報道Ⅱ型糖尿病患者腸道中擬桿菌數(shù)量增加[30]。Larsen等[31]研究結(jié)果也表明，Ⅱ型糖尿病患者腸道中厚壁菌門菌群的數(shù)量顯著減少，革蘭氏陰性菌群的數(shù)量增多。在本研究中，4種菌群中只有擬桿菌為革蘭氏陰性菌，且該菌在Ⅱ型糖尿病患者腸道中的含量顯著高于正常人群，而屬于厚壁菌門的柔嫩梭菌和乳桿菌含量均顯著低于后者，這一結(jié)果與上述研究[29-31]的結(jié)果不謀而合。

另外，在研究人體胖瘦與腸道菌群的關系時，有人發(fā)現(xiàn)瘦人消化道內(nèi)的細菌主要屬于擬桿菌，而胖人消化道內(nèi)的厚壁菌更多；胖人改為進食低熱量飲食后，擬桿菌門含量從3%增加到15%，而厚壁菌數(shù)量下降[32]。本研究中顯示在Ⅱ型糖尿病患者中，肥胖+高血糖患者組擬桿菌含量顯著低于單純高血糖患者組，而柔嫩梭菌和乳桿菌含量均顯著高于后者。而且從血糖、血脂指標的測定結(jié)果可以看出，肥胖、高血脂與糖尿病間有明顯的正相關性。

本研究中，對比是否用降糖藥這兩組，藥物治療后各血糖、血脂指標均恢復正常，4種菌群的含量與未用藥患者組相比也更接近正常人群。之前也有研究表明，降糖藥物對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用[15]，但藥物對腸道菌群是直接作用還是通過調(diào)節(jié)宿主代謝的間接作用，還有待更深入的研究。

值得注意的是，Ⅱ型糖尿病患者腸道內(nèi)雙歧桿菌含量較正常人群明顯增加，這與多項研究得出的結(jié)果[33-34]相矛盾，考慮可能原因為Ⅱ型糖尿病患者機體在高血糖狀態(tài)下，自身腸道菌群發(fā)生應激性改變導致雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，以逆轉(zhuǎn)機體慢性炎癥反應狀態(tài)，改善代謝性內(nèi)毒素血癥等，從而造成這一相悖的研究結(jié)果。由于腸道微生態(tài)系統(tǒng)太過復雜以及研究方法繁多，各項關于腸道菌群的研究結(jié)果不盡相同。許多研究顯示，補充益生菌后，肥胖、糖尿病患者的胰島素抵抗、系統(tǒng)性炎癥反應狀態(tài)、代謝性內(nèi)毒素血癥等可得到顯著改善[35]。

綜上所述，4種腸道菌群在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中充當了重要角色，其數(shù)量的變化與Ⅱ型糖尿病密切相關。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)在Ⅱ型糖尿病發(fā)病機制中起著重要的作用。目前關于家族遺傳是否會對Ⅱ型糖尿病患者腸道內(nèi)菌群結(jié)構造成差異的研究尚屬空白。本實驗結(jié)果表明：有無家族遺傳史對病人腸道內(nèi)4種菌群的含量在統(tǒng)計學意義上無影響。腸道菌群的定量分析是了解Ⅱ型糖尿病患者腸道內(nèi)菌群變化規(guī)律的基礎，本實驗通過初步探討正常人群與各種糖尿病患者腸道中4種重要菌群含量的差異和變化，有助于從新的角度更全面準確地了解各種病情程度患者腸道菌群的差異，為進一步尋找腸道菌群與Ⅱ型糖尿病之間的關系提供了重要線索，并為理解Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機制及尋求新的治療微生態(tài)靶點提供了一些資料。

[1]BIAGI E, NYLUND L, CANDELA M, et al. Through ageing, and beyond: gut microbiota and inflammatory status in seniors and centenarians[J]. PLoS ONE, 2010, 5(5): e10667. doi: 10.1371/journal. pone.0010667.

[2]SGHIR A, GRAMET G, SUAU A, et al. Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(5): 2263-2266.

[3]TIIHONEN K, OUWEHAND A C, RAUTONEN N. Human intestinal microbiota and healthy ageing[J]. Ageing Research Reviews, 2010, 9(2): 107-116.

[4]CANI P D, DELZENNE N M. The role of the gut microbiota in energy metabolism and metabolic disease[J]. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(13): 1546-1558.

[5]CANI P D, DELZENNE N M. Gut microflora as a target for energy and metabolic homeostasis[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care, 2007, 10(6): 729-734.

[6]VALLADARES R, SANKAR D, LI Nan, et al.Lactobacillus johnsoniiN6. 2 mitigates the development of type 1 diabetes in BB-DP rats[J]. PLoS ONE, 2010, 5(5): e10507. doi: 10.1371/journal.pone.0010507.

[7]HOOPER L V, MIDTVEDT T, GORDON J I. How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine[J]. Annual Review of Nutrition, 2002, 22(1): 283-307.

[8]KELLY D, CAMPBELL J I, KING T P, et al. Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclear-cytoplasmic shuttling of PPAR-γand RelA[J]. Nature Immunology, 2004, 5(1): 104-112.

[9]DUNCAN S H, LOUIS P, FLINT H J. Lactate-utilizing bacteria, isolated from human feces, that produce butyrate as a major fermentation product[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(10): 5810-5817.

[10] 車傳燕.人源菌群仔豬模型的建立及其胃腸道粘膜免疫的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學, 2009: 107-117.

[11] 江美玲. 2型糖尿病及其前期狀態(tài)人群腸道菌群特征分析[D].廣州:南方醫(yī)科大學, 2013: 10-35.

[12] 蔣曼,姚萍,楊濤,等.實時熒光定量PCR法研究潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道雙歧桿菌屬、柔嫩梭菌屬及擬桿菌屬量的變化[J].中國微生態(tài)學雜志, 2013, 25(11): 1245-1249.

[13]de OLIVEIRA M A, RIBEIRO E G A, BERGAMINI A M M, et al. Quantification ofListeria monocytogenesin minimally processed leafy vegetables using a combined method based on enrichment and 16S rRNA real-time PCR[J]. Food Microbiology, 2010, 27(1): 19-23.

[14]World Health Organization. WHO/NCD/NCS/99.2 Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications[R]. Geneva: WHO, 1999.

[15] 韓亮.藥物干預對先天高血糖小鼠腸道菌群的影響[D].太原:山西大學, 2013: 8-31.

[16]PANG Xiaoyan, DING Dezhong, WEI Guifang, et al. Molecular profiling ofBacteroidesspp. in human feces by PCR-temperature gradient gel electrophoresis[J]. Journal of Microbiological Methods, 2005, 61(3): 413-417.

[17]MATSUKI T, WATANABE K, FUJIMOTO J, et al. Use of 16S rRNA gene-targeted group-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(12): 7220-7228.

[18]WALTER J, HERTEL C, TANNOCK G W, et al. Detection ofLactobacillus,Pediococcus,Leuconostoc, andWeissellaspecies in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(6): 2578-2585.

[19]SATOKARI R M, VAUGHAN E E, AKKERMANS A D L, et al. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(2): 504-513.

[20] 申劍.寡果糖對人源菌群仔豬腸道菌群結(jié)構和宿主代謝的影響[D].上海:上海交通大學, 2008: 87-102.

[21] 李旻.人體腸道菌群結(jié)構與宿主代謝的相關性研究[D].上海:上海交通大學, 2009: 58-96.

[22] 張美玲.兩種腸道疾病中腸道菌群結(jié)構變化的分子生態(tài)學研究[D].上海:上海交通大學, 2007: 96-130.

[23] 魏華.不同外源擾動因素對腸道菌群組成結(jié)構影響的研究[D].上海:上海交通大學, 2008: 65-107.

[24] 徐靈筠. 1型糖尿病鼠類模型的腸道菌群分析[D].上海:上海交通大學, 2007: 31-58.

[25]CANI P D, OSTO M, GEURTS L, et al. Involvement of gut microbiota in the development of low-grade inflammation and type 2 diabetes associated with obesity[J]. Gut Microbes, 2012, 3(4): 279-288.

[26]de la SERRE C B, ELLIS C L, LEE J, et al. Propensity to highfat diet-induced obesity in rats is associated with changes in the gut microbiota and gut inflammation[J]. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2010, 299(2): G440-G448.

[27]MEHTA N N, MCGILLICUDDY F C, ANDERSON P D, et al. Experimental endotoxemia induces adipose inflammation and insulin resistance in humans[J]. Diabetes, 2010, 59(1): 172-181.

[28]DONATH M Y, B?NI-SCHNETZLER M, ELLINGSGAARD H, et al. Islet inflammation impairs the pancreaticβ-cell in type 2 diabetes[J]. Physiology, 2009, 24(6): 325-331.

[29]FURET J P, KONG L C, TAP J, et al. Differential adaptation of human gut microbiota to bariatric surgery-induced weight loss links with metabolic and low-grade inflammation markers[J]. Diabetes, 2010, 59(12): 3049-3057.

[30] 劉晶,王燁,李琳琳,等.新疆維吾爾族、哈薩克族2型糖尿患者群腸道菌群中直腸真桿菌與多形擬桿菌的定量研究[J].中國微生態(tài)學雜志, 2011, 23(2): 107-111.

[31]LARSEN N, VOGENSEN F K, van den BERG F W J, et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from nondiabetic adults[J]. PLoS ONE, 2010, 5(2): e9085. doi: 10.1371/journal. pone.0009085.

[32]MANCO M, PUTIGNANI L, BOTTAZZO G F. Gut microbiota, lipopolysaccharides, and innate immunity in the pathogenesis of obesity and cardiovascular risk[J]. Endocrine Reviews, 2010, 31(6): 817-844.

[33] 黃旭東,鄭曉鵬,鄭趙利. 2型糖尿病患者腸道菌群的研究[J].河北醫(yī)學, 2011, 17(8): 1041-1043.

[34]WU Xiaokang, MA Chaofeng, HAN Lei, et al. Molecular characterisation of the faecal microbiota in patients with type II diabetes[J]. Current Microbiology, 2010, 61(1): 69-78.

[35]PHILIPPE D, FAVRE L, FOATA F, et al.Bifidobacterium lactisattenuates onset of inflammation in a murine model of colitis[J]. World Journal of Gastroenterology, 2011, 17(4): 459-469.

Quantitative Analysis of Important Gut Flora in Diabetic Patients

ZANG Wenjuan1, LI Yanqin1,*, LI Binchun1, GUO Junjie2, ZHAO Yuli2
(1. Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Shanxi Province Institute of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030012, China)

Objective: To understand the relative contents and changes ofBacteroides,Bifi dobacterium,Clostridium leptumandLactobacillusin the intestinal flora of healthy people and diabetic patients with and without genetic inheritance, drug treatment or obesity for future prevention and treatment of diabetes. Methods: Fecal samples were collected from the above populations (n= 10). The total DNAs of microorganisms were extracted from the samples, and specific gene fragments from the four intestinal bacteria were amplified by fluorescence quantitative PCR. Differences and changes in these four bacterial species were studied. Results: The relative contents ofBacteroidesandBifi dobacteriumin healthy population were lower than those in diabetic population, while the relative contents ofClostridium leptumandLactobacillusin healthy population were higher than those in diabetic population. Among the diabetic population, the contents ofBacteroidesandBifidobacteriumafter drug treatment were lower than those before drug treatment, while the relative contents ofClostridium leptumandLactobacilluswere higher in patients without drug treatment. The contents ofBacteroidesandBifidobacteriumin obese patients with high blood glucose were lower than those of the patients with high blood glucose alone, while the relative contents ofClostridium leptumandLactobacilluswere higher in the formers. Genetic inheritance had no statistical significance. Conclusion: These four gut bacteria are closely related to the origination and development of diabetes. Their contents in diabetic patients with drug treatment are close to those in healthy population. Obesity aggravates the development of diabetes. Genetic inheritance has no effect on gut flora.

diabetes; gut flora; quantitative analysis;Bacteroides;Bifi dobacterium;Clostridium leptum;Lactobacillus

R587.1

1002-6630（2015）11-0208-07

10.7506/spkx1002-6630-201511040

2014-08-15

山西省科技攻關項目（20120311006-1）

臧文娟（1987—），女，碩士研究生，研究方向為微生物分子生態(tài)。E-mail：15581835511@163.com

*通信作者：李艷琴（1960—），女，教授，學士，研究方向為微生物生態(tài)。E-mail：yanqin@sxu.edu.cn