烏日娜，宋雪飛，劉倩穎，徐 鑫，王茜茜，武俊瑞,*

植物乳桿菌分子伴侶蛋白基因在鹽脅迫下的表達(dá)分析

烏日娜1,2，宋雪飛1，劉倩穎1，徐 鑫1，王茜茜1，武俊瑞1,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

以一株分離篩選自東北自然發(fā)酵大醬中的耐鹽植物乳桿菌FS5-5為實(shí)驗(yàn)對象，通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上對其分子伴侶蛋白的相應(yīng)基因在鹽脅迫下的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在菌體對數(shù)生長期，分子伴侶蛋白調(diào)控系統(tǒng)中，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp均受MRS培養(yǎng)基中NaCl的誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)，并且NaCl的質(zhì)量濃度越高，基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)越顯著，而hsp3雖受MRS培養(yǎng)基中NaCl的誘導(dǎo)表達(dá)有所上調(diào)，但其受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)顯著程度與NaCl質(zhì)量濃度不呈正相關(guān)。

植物乳桿菌；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；鹽脅迫；基因表達(dá)

植物乳桿菌是乳酸桿菌的一種短桿菌，菌體成對或成鏈狀排列分布，不產(chǎn)芽孢，厭氧或兼性厭氧，革蘭氏陽性菌，最適pH值為6.5左右[1]。植物乳桿菌是公認(rèn)的益生菌，植物乳桿菌代謝產(chǎn)物中，除氨基酸、短肽、乳酸外，還有多種有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素、雙乙 酰等諸多天然抑菌物質(zhì)[2]。植物乳桿菌具有諸多生理功能，包括：營養(yǎng)作用、改善胃腸道功能、抗腫瘤作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低膽固醇、平衡泌尿生殖系統(tǒng)菌群[3-4]。

在乳酸菌制品生產(chǎn)加工過程中，會經(jīng)歷高溫殺菌、噴霧干燥等高溫處理環(huán)節(jié)，這些處理會對菌體本身產(chǎn)生不同程度的迫害作用。熱應(yīng)激反應(yīng)所涉及的主要蛋白質(zhì)是分子伴侶蛋白（molecular chaperon），例如GroEL/GroES、DnaK、DnaJ，以及蛋白酶（如HtrA、FtsH、Clp）。這類蛋白質(zhì)的基因在菌體處于正常生長環(huán)境中時不表達(dá)或表達(dá)受抑制，但當(dāng)菌體受到熱或外界環(huán)境變化時，則會被激活而表達(dá)以保護(hù)菌體細(xì)胞[5]。鹽脅迫對菌體有很大的影響，例如鹽脅迫所引起的環(huán)境滲透壓的突然增加，使細(xì)胞內(nèi)的水分外流，引起細(xì)胞膨壓的損失，改變胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度和細(xì)胞體積[6]。

鹽脅迫對益生嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種菌體、益生乳酸桿菌都有一定的影響[7-9]。目前，很多關(guān)于滲透壓脅迫的研究主要關(guān)注的是滲透壓上升后，立即通過積累相容性溶質(zhì)的方式來恢復(fù)膨壓。然而，關(guān)于鹽脅迫下蛋白基因的表達(dá)情況的信息是有限的。熱應(yīng)激蛋白是普遍存在于所有種類生物中的分子伴侶蛋白，為了保護(hù)菌體細(xì)胞，熱應(yīng)激蛋白很有可能會對鹽脅迫造成的高滲透壓環(huán)境做出應(yīng)激反應(yīng)。在研究這些蛋白質(zhì)在鹽脅迫中的重要性時，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real time-PCR）技術(shù)成為重要的技術(shù)工具[10]。

植物乳桿菌是在食品及其他領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的發(fā)酵微生物，研究其發(fā)酵機(jī)理并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化具有重要的實(shí)踐意義。本實(shí)驗(yàn)以一株分離自東北自然發(fā)酵大醬樣品中的具有耐鹽特性的植物乳桿菌FS5-5[11]為實(shí)驗(yàn)菌株，并對其在NaCl質(zhì)量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL 4 個梯度下，生長至對數(shù)生長期的分子伴侶蛋白相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步開發(fā)耐鹽性發(fā)酵菌種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：從東北自然發(fā)酵大醬中分離篩選出一株耐鹽的植物乳桿菌FS5-5。

液體Man, Rogosa and Sharp（MRS）培養(yǎng)基（100 mL）：牛肉浸膏0.8 g、蛋白胨1 g、酵母粉0.4 g、無水乙酸鈉0.3 g、葡萄糖2 g、吐溫-80 0.1 g、K2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.058 g、檸檬酸鈉0.2 g、MnSO4·H2O 0.019 g、蒸餾水100 mL。

RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9080型生化培養(yǎng)箱 上海振宇化工科技有限公司；CR-21G型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；5418R小型臺式冷凍離心機(jī) 上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；NANODROP 8000濃度儀 美國熱電集團(tuán)；ABI 7500 Fast實(shí)時熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體收集

MRS培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL，分別取5 mL于若干試管中，蓋上試管塞，121 ℃滅菌20 min。待試管中培養(yǎng)基冷卻到室溫后，在無菌操作臺上，于無菌條件下用移液槍分別吸取100 ?L活化二代的菌液于上述各鹽質(zhì)量濃度試管中。于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別于接種后第8、10、10、12小時收集對數(shù)期菌體。

1.3.2 提取總RNA

按照天根生化科技（北京）有限公司RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書提取菌體總RNA。

1.3.3 合成cDNA第一鏈

按照天根公司TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)與合成方法

本實(shí)驗(yàn)確定管家基因?yàn)?6S rRNA，目的基因?yàn)闊峒さ鞍渍{(diào)控系統(tǒng)（groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、hsp3、usp）。在GenBank網(wǎng)站查詢?nèi)抗芗一蚝湍康幕虻男蛄?，引物設(shè)計(jì)軟件為Primer 5。引物送上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。管家基因和目的基因的引物見表1。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative PCR

1.3.5 real time-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

按照天根生化科技（北京）有限公司Real Master Mix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：熒光染料混合液9 μL、cDNA模板2 μL、正向引物2 μL、反向引物2 μL、超純水5 μL。

PCR擴(kuò)增條件：變性：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 33 s，68℃ 34 s，循環(huán)40 次；熔解曲線：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

1.4數(shù)據(jù)分析

作圖軟件為Excel，用軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRS培養(yǎng)基中的NaCl對基因groEL、groES、dnaK、dnaJ表達(dá)的影響

圖1 1基因ggrrooEELL、groES、dnaK、dnaJ、uusspp、hsp1、hsp2、hsp3受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig.1 Expression of genes induced by NaCl

由圖1A～1D可以看出，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ受誘導(dǎo)程度也隨之增加。與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，且與NaCl質(zhì)量濃度為3 g/100 mL比較，表達(dá)差異顯著（P＜0.05）；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，且與NaCl質(zhì)量濃度為3、6 g/100 mL比較，表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。

Kilstrup等[12]的研究表明，對于乳酸乳球菌，大多數(shù)鹽脅迫誘導(dǎo)蛋白也被熱脅迫所誘導(dǎo)。分子伴侶蛋白DnaK、GroEL和GroES受2.5 g/100 mL NaCl的誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)了5～9 倍。Meury等[13]對大腸桿菌的研究表明，30 ℃添加NaCl條件下，K+吸收和去質(zhì)壁分離過程中，DnaK蛋白質(zhì)水平大幅度增加。他們從一株野生型大腸桿菌分離出蛋白，利用免疫印跡法對DnaK蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在添加NaCl后1～5 min時間里，DnaK蛋白質(zhì)水平上升了2～3 倍。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定增長反映了合成速率的大幅度增長。根據(jù)以上研究，乳酸乳球菌和大腸桿菌的分子伴侶蛋白基因在鹽脅迫下將會表達(dá)上調(diào)，使分子伴侶蛋白的合成量增加。本實(shí)驗(yàn)中，對于植物乳桿菌，分子伴侶蛋白基因groEL、groES、dnaK、dnaJ也受NaCl的誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)，并且NaCl的質(zhì)量濃度越高，基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)越顯著，可見這些基因的誘導(dǎo)表達(dá)程度與NaCl質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

2.2 MRS培養(yǎng)基中的NaCl對基因usp表達(dá)的影響

由圖1E可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，基因usp受誘導(dǎo)程度也隨之增加。與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，且與NaCl質(zhì)量濃度為3 g/100 mL比較，表達(dá)差異顯著（P＜0.05）；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，且與NaCl質(zhì)量濃度為3、6 g/100 mL比較，表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。

Usp為通用應(yīng)激蛋白（universal stress protein），通常被好幾種脅迫誘導(dǎo)，參與DNA或蛋白質(zhì)修復(fù)[14]。在不利的環(huán)境壓力下，Usps的產(chǎn)量增加，并且通過一系列的機(jī)制來幫助微生物生存[15]。黃桂東[16]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對乳酸菌Lactobacillus brevis NCL912在酸脅迫下菌體蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：酸脅迫誘導(dǎo)通用應(yīng)激蛋白UspA表達(dá)上調(diào)。宋維志等[17]的研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度高于最適鹽度時，無論溫度高低，南極適冷菌Psychrobacter sp.G的一個通用應(yīng)激蛋白（USP）基因usp1141的表達(dá)均會提高。本實(shí)驗(yàn)中，對于植物乳桿菌，分子伴侶蛋白基因usp也受NaCl的誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)，因此蛋白Usp的產(chǎn)量增加，以便更好地起到修復(fù)蛋白的作用。并且NaCl的質(zhì)量濃度越高，基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)越顯著，可見基因usp的誘導(dǎo)表達(dá)程度與NaCl質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

2.3 MRS培養(yǎng)基中的NaCl對基因hsp1、hsp2、hsp3表達(dá)的影響

由圖1F、1G可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，基因hsp1、hsp2受誘導(dǎo)程度也隨之增加。與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，且與NaCl質(zhì)量濃度為3 g/100 mL比較，表達(dá)差異顯著（P＜0.05）；與NaCl質(zhì)量濃度為 0 g/100 mL比較，在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，且與NaCl質(zhì)量濃度為3、6 g/100 mL比較，表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。

由圖1H可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，基因hsp3受誘導(dǎo)程度并沒有呈規(guī)律性變化。與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，基因hsp3在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，基因hsp3在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)；與NaCl質(zhì)量濃度為0 g/100 mL比較，基因hsp3在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)。

Hsp1、Hsp2、Hsp3為小熱激蛋白sHsp。小熱激蛋白以動態(tài)低聚物的復(fù)合物形式存在，并且有多種生物學(xué)功能[18]。小熱激蛋白與大分子質(zhì)量熱激蛋白，都具有分子伴侶作用，能修復(fù)蛋白質(zhì)、阻止蛋白質(zhì)錯誤折疊[19-21]，但仍然缺乏對其統(tǒng)一分子機(jī)制的理解[22]。Yeh等[23]的研究表明，重組的大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)了一種大小為16.9 kD的小熱激蛋白Oshsp16.9后，耐熱性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中，對于植物乳桿菌，分子伴侶蛋白基因hsp1、hsp2也受NaCl的誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)，因此蛋白Hsp1、Hsp2的產(chǎn)量增加，以便更好地起到修復(fù)蛋白的作用。并且NaCl的質(zhì)量濃度越高，基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)越顯著，可見基因hsp1、hsp2的誘導(dǎo)表達(dá)程度與NaCl質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。然而基因hsp3雖受NaCl誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，但誘導(dǎo)表達(dá)程度與NaCl質(zhì)量濃度的關(guān)系不呈正相關(guān)。環(huán)境滲透壓的升高，影響蛋白質(zhì)的生物活性、結(jié)構(gòu)和功能[24-25]，基因hsp3結(jié)構(gòu)本身及其表達(dá)的蛋白Hsp3可能也受滲透壓的影響，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 論

分子伴侶蛋白基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp、hsp3受到NaCl脅迫時均受到誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，分子伴侶蛋白的量提高。環(huán)境滲透壓的升高，影響蛋白質(zhì)的生物活性、結(jié)構(gòu)和功能，分子伴侶蛋白通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)修復(fù)和折疊作用，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、功能特性，這便是分子伴侶蛋白的作用機(jī)理?；騡roEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp的誘導(dǎo)表達(dá)程度與NaCl質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，即NaCl的質(zhì)量濃度越高，基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)越顯著。說明這些基因本身及合成的蛋白都能耐受鹽脅迫。而基因hsp3面對不同強(qiáng)度的滲透壓脅迫時，雖表達(dá)均有上調(diào)，但變化趨勢與NaCl質(zhì)量濃度不呈正相關(guān)。面對高質(zhì)量濃度NaCl帶來的滲透壓脅迫，基因hsp3結(jié)構(gòu)本身或其表達(dá)的蛋白Hsp3受到了破壞，不能全面發(fā)揮其修復(fù)蛋白的作用；或者是Hsp3的功能與植物乳桿菌的耐鹽性相關(guān)性不是很高，但具體機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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Expression of Chaperone Protein Genes in Lactobacillus plantarum under Salt Stress

WU Rina1,2, SONG Xuefei1, LIU Qianying1, XU Xin1, WANG Qianqian1, WU Junrui1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The objective of this study was to isolate a salt-tolerant Lactobacillus plantarum (FS5-5) from naturally fermented miso in northeastern China. The expression of chaperone protein genes under salt stress at the transcriptional level was evaluated by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (real time-PCR). Results showed that in the exponential growth phase, the chaperone protein genes such as groEL, groES, dnaK, dnaJ, hsp1, hsp2, and usp were induced by NaCl in MRS medium and their expressions were up-regulated. The higher NaCl concentration was, the more significant the up-regulation was. Similarly, the heat shock protein gene hsp3 was induced by NaCl in MRS medium and its expression was up-regulated, but the induced up-regulation was not positively correlated with NaCl concentration.

Lactobacillus plantarum; real-time fl uorescence quantitative polymerase chain reaction (real time-PCR); salt stress; gene expression

Q93

A

10.7506/spkx1002-6630-201511019

2014-11-25

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31000805）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471713）；

中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014M560395）；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目（2014048）；

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)“天柱山英才支持計(jì)劃”項(xiàng)目

烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wrn6956@163.com

*通信作者：武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：junruiwu@126.com