陳 彤，王常青*，連偉帥，寧慶鵬，白云云，李小凡，郝志萍

沙棘籽渣酶解產(chǎn)物的體內(nèi)外抑菌作用

陳 彤，王常青*，連偉帥，寧慶鵬，白云云，李小凡，郝志萍

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

以沙棘籽渣為原料，采用水提法提取沙棘籽渣蛋白，再用ProteAX復(fù)合蛋白酶和胃蛋白酶兩種酶酶解，利用膜過濾對其分離純化，得到具有抑菌活性的沙棘籽渣蛋白酶解物。體外實驗結(jié)果表明：ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌均有抑制作用，胃蛋白酶水解多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有抑制作用。動物實驗表明：胃蛋白酶水解多肽灌胃的小鼠糞便中，沙門氏菌的菌落總數(shù)與陽性對照組相比顯著減少（P＜0.05）；而灌胃ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽的小鼠糞便中，金黃色葡萄球菌的菌落總數(shù)比陽性對照組顯著降低（P＜0.05）。

沙棘籽渣酶解物；抑菌作用；體內(nèi)外實驗

沙棘是一種珍貴的藥食兩用作物，其中含有VA、VC、VE等多種維生素，還有豐富的黃酮類、原花青素等生物活性物質(zhì)[1]。沙棘籽渣是沙棘榨油后的工業(yè)廢物，常用作動物飼料[2]，但其中的蛋白利用率很低。經(jīng)測定，沙棘籽渣中含有25%～30%的蛋白質(zhì)[3]，如果能夠?qū)⑦@些蛋白質(zhì)有效地水解加工成小分子的多肽，不但可以大大提高利用率，而且還有許多保健作用。近年來，國內(nèi)外市場上的沙棘提取物主要為沙棘籽油、沙棘果油、沙棘果粉、原花青素、沙棘黃酮、沙棘膳食纖維等[4-6]，關(guān)于沙棘籽渣多肽的研究較少，對其功能性研究更少[7-9]，尚未見到關(guān)于沙棘籽渣抗菌肽方面的研究。本實驗以脫脂沙棘籽渣為原料，采用蛋白酶水解制備沙棘籽渣抗菌多肽，并對其體內(nèi)外抑菌作用進(jìn)行研究，旨在為能夠充分利用沙棘蛋白資源，開發(fā)出天然植物源的抑菌劑開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1材料、動物與試劑

沙棘籽渣為二氧化碳超臨界提油后的殘渣，粗蛋白含量26.25%，山西五臺山沙棘制品有限公司提供；金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌 中科院微生物研究所。

胃蛋白酶（酶活力3 000 U/g）廣西龐博生物工程有限公司；ProteAX復(fù)合蛋白酶（酶活力24 000 U/g）日本天野酶制品株式會社。

清潔級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20～25 g，山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（晉）2009-0001，動物使用合格證號為SCXK（晉）2009-0004。

金黃色葡萄球菌試紙片、沙門氏菌試紙片廣州綠洲科技股份有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、桿菌肽北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Sephadex凝膠色譜系統(tǒng)、UVD-680-3紫外檢測儀上海金達(dá)生物科技有限公司；SP-2012UVPC紫外分光光度計上海光譜儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1沙棘籽渣酶解產(chǎn)物的制備

沙棘籽渣經(jīng)粉碎、過篩和去雜等預(yù)處理后，以料液比1∶15（m/V）加水，浸泡過夜，在前期實驗摸索出的蛋白酶最佳條件下加入蛋白酶水解[10-12]。胃蛋白酶的酶解條件：溫度40℃、pH 2.5、水解時間3 h、加酶量3 000 U/g；ProteAX復(fù)合蛋白酶的酶解條件：溫度50℃、pH 6.5、水解時間4 h、加酶量3 000 U/g。水解多肽滅酶后經(jīng)微濾和孔徑為5 000 D的超濾膜超濾以除去大分子雜質(zhì)，經(jīng)孔徑為500 D的納濾膜納濾以除去大部分鹽分、原花青素、黃酮等小分子雜質(zhì)，得到實驗用多肽，經(jīng)測定蛋白質(zhì)純度分別為78.44%和82.72%。

1.3.2多肽得率及分子質(zhì)量測定

多肽含量采用QB/T 2879—2007《海洋魚低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法測定，按照下式計算多肽得率。

多肽分子質(zhì)量的測定采用Sephadex G-25凝膠色譜法[13]，測檢波長為220 nm。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的Marker為胸腺肽（3 108 D）、桿菌肽（1 486 D）和還原性谷胱甘肽（307 D）。以Marker的分子質(zhì)量對數(shù)值（lgM）為橫坐標(biāo)，洗脫體積（Ve）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Ve=-30.55 lgM+192.12。用峰面積歸一法計算出多肽水解液的分子質(zhì)量分布范圍。

1.3.3體外抑菌實驗

選大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌，以質(zhì)量濃度為20 mg/mL的沙棘籽渣酶解物進(jìn)行抑菌圈實驗，采用平板打孔法，操作步驟參照文獻(xiàn)[14]：每個孔內(nèi)加入20 μL的待檢物，設(shè)無菌水為空白對照組，1 mg/mL的桿菌肽溶液作為陽性對照組，培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)48 h，測量各抑菌圈的直徑，抑菌圈的直徑比空白對照組明顯增大，則表示該沙棘籽渣多肽有抑菌作用。

1.3.4菌懸液濃度曲線及最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

將已活化的金黃色葡萄球菌及沙門氏菌用無菌生理鹽水配制成菌懸液，將該液適當(dāng)稀釋后在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)[15]，取同一菌懸液，配制稀釋2、4、8、16、32、64倍的系列標(biāo)樣，在600 nm波長處以比色皿比濁，以無菌水為參比，分別測定其吸光度A600nm；以血球計數(shù)板所測的菌體含量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的系列標(biāo)樣吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用二倍稀釋法驗證沙棘籽渣酶解物的抑菌作用，并測定沙棘籽渣酶解物的MIC[16]，即取10支無菌試管編號，1～8號為沙棘籽渣酶解物質(zhì)量濃度為160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 mg/mL的含菌（菌濃度為108CFU/mL）稀釋液；9號為取1 mL菌懸液，不加實驗藥物的菌液對照管；10號管為取1 mL沙棘籽渣多肽，不加菌懸液的藥物對照管，搖勻后于37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為首先觀察9號菌液對照管細(xì)菌呈混濁狀生長，而10號藥物對照管無細(xì)菌生長呈透明狀的前提下，以不出現(xiàn)混濁的最低沙棘籽渣多肽質(zhì)量濃度為其MIC。

1.3.5體內(nèi)抑菌實驗

將復(fù)蘇生長良好的篩選菌種分別配成108CFU/mL菌懸液，取清潔級昆明小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只[17-23]。A組為正常對照組，灌胃無菌生理鹽水0.5 mL/d；B、C、D組每只小鼠灌胃金黃色葡萄球菌菌懸液0.5 mL/d；E、F、G組每只小鼠灌胃沙門氏菌菌懸液0.5 mL/d；感染第7天對所有小鼠的糞便進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，確認(rèn)模型復(fù)制成功后，B、E為陽性對照組，每只小鼠每天灌胃1 mg/mL的桿菌肽溶液（多肽類抗生素）0.5 mL；C、D組分別為ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽低、高劑量組，分別給予每只小鼠每天灌胃20、160 mg/mL的ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽0.5 mL（相當(dāng)于0.34、2.7 g/（kg·d），下同）；F、G組分別為胃蛋白酶水解多肽低、高劑量組，分別給予每只小鼠每天灌胃20、160 mg/mL的胃蛋白酶水解液0.5 mL；以糞便細(xì)菌培養(yǎng)菌落總數(shù)為評價指標(biāo)，比較各組與陽性對照組的差異。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計處理，實驗結(jié)果以±s表示，用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1酶解產(chǎn)物得率及多肽分子質(zhì)量分析

圖1 ProteAX復(fù)合蛋白酶（A）、胃蛋白酶（B）水解多肽的G-25凝膠色譜圖Fig.1 Sephadex G-25 profiles of enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue with ProteAX protease (A) and pepsin (B)

表1 兩種沙棘籽渣酶解產(chǎn)物的主要成分及含量Table 1 Contents of main constituents in two enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

由圖1、表1可知，ProteAX復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物得率和水解液中多肽含量比胃蛋白酶酶解產(chǎn)物高12.64%和0.19%。兩種酶水解多肽分子質(zhì)量分布也有差異，其中ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽在＜1 000 D的分子質(zhì)量比例比胃蛋白酶水解多肽高8.57%；而胃蛋白酶水解多肽在1 000～5 000 D和＞5 000 D分子段的百分率比ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽高5.66%和2.91%。根據(jù)沙棘籽渣酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，猜測沙棘籽渣酶解產(chǎn)物中起抑菌活性的成分可能為＜1 000 D的短肽。

2.2體外抑菌實驗結(jié)果

表2 沙棘籽渣酶解物的體外抑菌實驗Table 2 Antibacterial activityin viittrrooof two enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

圖2 沙棘籽渣酶解物的體外抑菌圈Fig.2 Bacteriostasisin vitroof two enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

由表2可知，ProteAX復(fù)合酶水解多肽對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌都具有抑菌作用，且對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)（圖2A）。胃蛋白酶水解多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌都具有抑菌作用，且對沙門氏菌抑菌作用最強(qiáng)（圖2B）。為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)抑菌實驗，測定ProteAX復(fù)合酶水解多肽對金黃色葡萄球菌菌懸液的MIC、胃蛋白酶水解多肽對沙門氏菌菌懸液的MIC，驗證這兩種沙棘籽渣酶解物的抑菌作用。

2.3菌懸液含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

以所測的菌體含量為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的系列標(biāo)樣吸光度為縱坐標(biāo)，得到金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.545 9x-11.994（R2=0.983 7）；沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.612 5x-12.679（R2=0.991 2）。該線性回歸方程可用于測定菌懸液含量。

2.4最低抑菌濃度測定結(jié)果

表3 沙棘籽渣酶解物的MICTble 3 MIC of enzyymatic hydrolysates of sea bucckthorn seed residue

由表3可知，ProteAX復(fù)合蛋白酶酶解物的抑菌作用要優(yōu)于胃蛋白酶，且對金黃色葡萄球菌的MIC為10 mg/mL，而胃蛋白酶酶解物對沙門氏菌的MIC為20 mg/mL，故選用20 mg/mL的兩種多肽水解液作為體內(nèi)抑菌實驗的低劑量組。

2.5體內(nèi)抑菌實驗結(jié)果

小鼠感染金黃色葡萄球菌及沙門氏菌模型成功建立后，灌胃不同種類及劑量沙棘籽渣酶解產(chǎn)物，在不同時間采取新鮮糞便進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表4。

表4 沙棘籽渣酶解物的體內(nèi)抑菌實驗結(jié)果Table 4 Antibacterial activity in viivvooof enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

由表4可知，對于金黃色葡萄球菌組，灌胃ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽的高劑量組小鼠染菌3、7、9、12、14 d后，糞便內(nèi)金黃色葡萄球菌的菌落總數(shù)顯著低于陽性對照組，而低劑量組與陽性對照組相比，灌胃12、14 d后才有明顯差異，說明ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽在2.7 g/（kg·d）劑量下有較強(qiáng)的體內(nèi)抑菌作用。對于沙門氏菌組，灌胃高劑量胃蛋白酶水解多肽的小鼠染菌7、9、12、14 d后，糞便內(nèi)沙門氏菌數(shù)的菌落總顯著低于陽性對照組，而低劑量組在灌胃9、12 d后才顯著低于陽性對照組，這說明胃蛋白酶水解多肽在0.34 g/（kg·d）劑量下對沙門氏菌的生長有一定的抑制作用，在2.7 g/（kg·d）劑量下抑制效果更好。

3 結(jié) 論

本實驗以ProteAX復(fù)合蛋白酶及胃蛋白酶對沙棘籽渣水提蛋白進(jìn)行酶解，得到兩種有抑菌活性的酶解物。通過體內(nèi)外抑菌實驗表明，其均對常見腸道致病菌有明顯的抑菌效果。ProteAX復(fù)合蛋白酶水解沙棘籽渣的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌均有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為10 mg/mL，而胃蛋白酶水解多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有抑制作用，其中對沙門氏菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為20 mg/mL。動物實驗結(jié)果表明，灌胃胃蛋白酶水解多肽的鼠糞中沙門氏菌的含菌量比陽性組顯著減少（P＜0.05），而灌胃ProteAX復(fù)合蛋白酶水解多肽的鼠糞中金黃色葡萄球菌含菌量顯著降低（P＜0.05），故兩種酶解物均可被進(jìn)一步開發(fā)，應(yīng)用于食品防腐保鮮中。

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Antibacterial Activity in vivo and in vitro of Enzymatic Hydrolysates of Sea Buckthorn Seed Residue

CHEN Tong, WANG Changqing*, LIAN Weishuai, NING Qingpeng, BAI Yunyun, LI Xiaofan, HAO Zhiping (College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this work, we obtained antibacterial peptides by enzymatic hydrolysis of water-soluble proteins from the residue left after supercritical carbon dioxide extraction of seed oil from sea buckthorn seeds with ProteAX protease and pepsin respectively and purifi cation of the resultant hydrolysates by membrane fi ltration. in vitro test results indicated that the ProteAX hydrolysate possessed bacteriostasis on Staphylococcus aureus, Salmonella, and Pseudomonas aeruginosa, while the pepsin hydrolysate possessed bacteriostasis on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella. Animal test results showed that the count of Salmonella in the feces of mice administered by gavage with the pepsin hydrolysate was signifi cantly reduced (P < 0.05) when compared with the positive group, whereas the count of Staphylococcus aureus in the feces of mice orally administered with the ProteAX hydrolysate was signifi cantly lower (P < 0.05) when compared with the positive group.

enzymatic hydrolysate of sea buckthorn seed residue; bacteriostatic activity; in vivo and in vitro test

X792

A

10.7506/spkx1002-6630-201511018

2014-09-01

陳彤（1992—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品開發(fā)。E-mail：chentong0307@163.com

*通信作者：王常青（1956—），男，教授，本科，研究方向為食品生物技術(shù)與功能食品的開發(fā)。E-mail：wcq@sxu.edu.cn