李名薇，孫建霞，許 偉，鄒飛雁,*，白 順，朱翠娟，胡云峰，焦 睿，吳 實(shí)，歐仕益，馮夢(mèng)鴿，白衛(wèi)濱,*

丙烯酰胺對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C活性及孕酮合成功能的影響

李名薇1，孫建霞2，許 偉1，鄒飛雁1,*，白 順1，朱翠娟1，胡云峰1，焦 睿1，吳 實(shí)1，歐仕益1，馮夢(mèng)鴿1，白衛(wèi)濱1,*

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510632；2.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州510006）

目的：研究丙烯酰胺（acrylamide，AA）對(duì)體外培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C生長(zhǎng)及孕酮合成功能的影響。方法：用濃度為0.25、0.5、0.75、1、2、4、6 mmol/L的AA作用于R2C細(xì)胞24 h，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法獲得IC25、IC50及IC75的AA作用濃度。用以上3種濃度的AA處理R2C細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞形態(tài)。AA作用于R2C細(xì)胞4 h后，通過彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）檢測(cè)細(xì)胞DNA的損傷程度；放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）測(cè)定AA處理R2C細(xì)胞4 h和24 h后的孕酮合成量。結(jié)果：AA能抑制R2C細(xì)胞活性，其IC25、IC50、IC75分別為1.140、1.925、3.250 mmol/L；3種濃度的AA能不同程度地影響R2C細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；作用4 h對(duì)R2C細(xì)胞DNA有損傷作用；各濃度組作用24 h后均能降低R2C細(xì)胞的孕酮合成量。結(jié)論：AA能影響R2C細(xì)胞增殖及孕酮合成能力。

丙烯酰胺；R2C細(xì)胞；細(xì)胞活性；DNA損傷；孕酮

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一種廣泛存在于常見食品及工業(yè)生產(chǎn)中的化學(xué)物質(zhì)[1-3]，它被認(rèn)為是一種對(duì)人類有潛在致癌作用的物質(zhì)[4]。2002年4月，瑞典國(guó)家食品管理局宣布在富含碳水化合物，如薯片、咖啡、烤面包等的熱處理過程中會(huì)產(chǎn)生大量的丙烯酰胺[5-6]，這一發(fā)現(xiàn)引起了廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道，丙烯酰胺具有基因毒性、神經(jīng)毒性及生殖毒性等，對(duì)人類具有致癌的危害性[7-8]。Yang等[9]通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較低劑量的AA即可抑制睪丸內(nèi)精子的生成，影響大鼠的生殖功能，然而 其造成雄性生殖毒性的具體機(jī)制還不確定。本研究通過探索丙烯酰胺對(duì)體外大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C的毒性損傷情況，探討其引起生殖毒性的機(jī)制，為丙烯酰胺的安全性評(píng)估提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

R2C細(xì)胞，由暨南大學(xué)生物醫(yī)藥中心實(shí)驗(yàn)室提供。

AA（CAS登錄號(hào)：79-06-01，純度98%） 德州市富凱化工有限責(zé)任公司；F12培養(yǎng)液、馬血清 美國(guó)Life公司；胎牛血清、胰酶 美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜（dimethy l sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國(guó)Amresco公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖、正常熔點(diǎn)瓊脂糖 美國(guó)FMC公司；Tris、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100） 美國(guó)Genview公司；孕酮放射免疫試劑盒 北方生物技術(shù)研究所。

37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；低溫離心機(jī) 金壇市富華儀器公司；GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)儀科大創(chuàng)新股份中佳公司。

1.2方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)AA對(duì)R2C細(xì)胞活性的影響

將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的R2C細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL懸液，4×103個(gè)細(xì)胞。24 h后，加入無血清F12培養(yǎng)液稀釋的濃度為0.25、0.5、0.75、1、2、4、6 mmol/L的AA，每組3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置無細(xì)胞的空白組（只加200μLF12培養(yǎng)液）和對(duì)照組（加200μL細(xì)胞懸液，不加AA），重復(fù)3次。作用24 h后，每孔加10μL5 mg/mL的MTT試劑，放于37 ℃培養(yǎng)箱。4 h后，去除液體，加200μLDMSO，置于脫色搖床搖動(dòng)10 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，按照下式計(jì)算AA對(duì)R2C細(xì)胞活性的抑制率。

式中：A0、A1、A2分別為空白組、AA給藥組、對(duì)照組的吸光度。

將得到的數(shù)據(jù)通過Graphpad軟件分析AA作用的IC25、IC50和IC75。

1.2.2倒置顯微鏡觀察AA對(duì)R2C形態(tài)的影響

將R2C細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的濃度接種于6孔板，加入IC25、IC50和IC75濃度的AA作用24 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.3彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）檢測(cè)AA對(duì)R2C細(xì)胞DNA的損傷

R2C細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔板。培養(yǎng)24 h，分別加入IC25、IC50和IC75濃度的AA作用于細(xì)胞。4 h后將對(duì)照組及經(jīng)過3種濃度AA處理的R2C細(xì)胞消化、離心后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗1遍。

將細(xì)胞重懸于0.8%的低熔點(diǎn)瓊脂糖（low melting agarose，LMP）中，取100μL到已預(yù)涂了一層正常熔點(diǎn)瓊脂糖的載玻片上，然后在最上層再加一層LMP。待瓊脂糖凝固后，將載玻片置于裂解液（0.1 mol/L EDTA-Na2、2.5 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris、體積分?jǐn)?shù)1%的Triton X-100、體積分?jǐn)?shù)10%的DMSO，臨用前配制，pH 10.0）中，5℃處理1 h。將載玻片放在堿性電泳緩沖液（0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L EDTA-Na2，pH 13.6）中處理20 min。堿性條件下（pH 13.6）進(jìn)行電泳（25 V、20 min）。電泳結(jié) 束后，用pH 7.5的Tris-HCl溶液將載玻片洗3次，每次5 min。用20μL25μg/mL的溴化乙錠（ethidium bromide，EB）對(duì)DNA染色，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡拍照，CASP軟件分析電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4放射免疫法（radioimmunoassav，RIA）檢測(cè)AA對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成量的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的R2C細(xì)胞調(diào)整濃度為106個(gè)/mL，接種到6孔板，每孔1 mL。24 h后加入AA濃度為IC25、IC50和IC75的培養(yǎng)液。4 h或24 h后收集上清液，并保存于-20 ℃。按孕酮放射免疫試劑盒說明書方法進(jìn)行孕酮合成量的測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 AA對(duì)R2C細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

由圖1可知，AA對(duì)R2C細(xì)胞活性的抑制率隨其濃度的增加而升高。通過Graghpad軟件分析得到AA對(duì)R2C細(xì)胞的IC25、IC50、IC75分別為1.140、1.925、3.250 mmol/L。

圖1 不同濃度AA對(duì)R2C細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Fig.1 Inhibitory ratios of AA on the growth of R2C cells

圖2 不同濃度AA作用24 h后的R2C細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig.2 Morphological changes of R2C cells after being exposed tovarious concentrations of AA for 24 h (× 400)

由圖2可知，濃度分別為1.140、1.925、3.250 mmol/L（IC25、IC50、IC75）的AA作用24 h后，R2C細(xì)胞變小，形狀由不規(guī)則多邊形變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞數(shù)目減少且貼壁能力降低，且AA對(duì)R2C細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.2 AA對(duì)R2C細(xì)胞DNA損傷的作用

圖3 不同濃度AA刺激4 h后R2C細(xì)胞的尾部DNA含量Fig.3 Tail DNA content in R2C cells after being exposed to AA for 4 h

由圖3～5可知，與對(duì)照組相比，不同濃度的AA作用于R2C細(xì)胞4 h后，細(xì)胞拖尾現(xiàn)象顯著增加。R2C細(xì)胞的尾部DNA含量、尾長(zhǎng)及Olive尾距（Olive tail moment，OTM）均隨AA濃度增加而增大，尤其當(dāng)AA濃度為1.925、3.250 mmol/L（IC50、IC75）時(shí)，其尾部DNA含量、尾長(zhǎng)和OTM分別增加了1 166.6%、1 776.7%，106.4%、295.7%和329.3%、476.9%，結(jié)果較對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表明AA可以誘導(dǎo)R2C細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷。

圖4 不同濃度AA刺激4 h后R2C細(xì)胞的尾長(zhǎng)Fig.4 Tail length of R2C cells after being exposed to AA for 4 h

圖5 不同濃度AA刺激4 h后R2C細(xì)胞的Olive尾距Fig.5 Olive tail moment of R2C cells after being exposed to AA for 4 h

2.3 AA對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成量的影響

圖6 不同濃度AA作用4 h后對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成量的影響Fig.6 Effect of AA exposure for 4 h on progesterone biosynthesis of R2C cells

圖7 不同濃度AA作用24 h后對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成量的影響Fig.7 Effect of AA exposure for 24 h on progesterone biosynthesis of R2C cells

孕酮合成量檢測(cè)結(jié)果表明，AA作用R2C細(xì)胞4 h后，各AA濃度組細(xì)胞的孕酮合成量與對(duì)照組相比無明顯差異（圖6）。AA繼續(xù)作用R2C細(xì)胞24 h后，各AA濃度組細(xì)胞的孕酮合成量顯著降低，與對(duì)照組相比分別降低了19.5%、28.6%及34.2%（圖7），且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且隨著AA作用濃度增加，抑制效果更加明顯。

3 討 論

研究報(bào)道丙烯酰胺具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性和生殖毒性[10]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，AA能夠?qū)?dòng)物生殖器官產(chǎn)生毒性作用[11-12]，并證明AA是通過干擾類固醇激素的合成來影響動(dòng)物的生殖功能[13]。Chen等[14]研究表明，AA能夠損傷大鼠睪丸，引起生殖功能的下降，但未通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行研究。從大鼠體內(nèi)分離睪丸間質(zhì)原代細(xì)胞程序復(fù)雜，并且不能傳代培養(yǎng)，限制了其作為評(píng)估模型的應(yīng)用[15]，而R2C細(xì)胞是一個(gè)能在無激素刺激條件下持續(xù)大量分泌孕酮的睪丸間質(zhì)細(xì)胞株，且具有無限傳代的能力，可作為一種快速評(píng)價(jià)雄性生殖毒性的細(xì)胞模型[16-17]。故本研究以睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過檢測(cè)細(xì)胞的生物活性及功能等來探討AA的毒性作用。

目前對(duì)AA體外生殖毒理的研究還比較少，因此本實(shí)驗(yàn)AA刺激劑量的選擇主要是參考Mehri等[18]研究AA體外神經(jīng)毒性的數(shù)據(jù)，進(jìn)而確定AA刺激劑量范圍以探討其生殖毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AA能夠抑制R2C細(xì)胞的活性、影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)，且上述抑制效果與AA的作用劑量成正相關(guān)。因此，AA可能通過抑制生殖細(xì)胞的活性來干擾生殖系統(tǒng)的功能。單細(xì)胞電泳結(jié)果表明，AA可以誘導(dǎo)R2C細(xì)胞發(fā)生明顯的DNA損傷。有研究表明，DNA損傷能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活力甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19-20]。由此推測(cè)，AA對(duì)R2C細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷有關(guān)。類固醇激素對(duì)于維持動(dòng)物生殖功能起著重要的作用[21]，睪丸間質(zhì)細(xì)胞最主要的功能是分泌睪酮[22]，而孕酮是睪酮合成的前體物，是其合成通路中最重要的中間產(chǎn)物，睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型R2C細(xì)胞株由于17β-羥化酶功能損壞、17β-羥類固醇脫氫酶缺失導(dǎo)致其僅能分泌孕酮，通過檢測(cè)孕酮水平可間接反映睪酮的分泌量[23-24]，所以將睪酮合成的前體物質(zhì)——孕酮作為評(píng)價(jià)生殖功能的指標(biāo)。有研究顯示[25]，體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在4 h時(shí)睪酮分泌量達(dá)到最大，考慮時(shí)間依賴的影響，本實(shí)驗(yàn)選取4 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA作用于R2C細(xì)胞4 h后對(duì)孕酮合成量無明顯影響，作用24 h后與對(duì)照組相比，3種濃度的AA均能引起R2C細(xì)胞孕酮合成量顯著降低，且AA濃度越大，降低程度越明顯。該結(jié)果說明，AA能造成R2C細(xì)胞孕酮合成功能下降，進(jìn)而能夠影響睪酮的合成，且抑制呈時(shí)間-劑量依賴性。

根據(jù)上述結(jié)果可以推測(cè)，AA可能是通過損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞DNA，造成相關(guān)蛋白合成受阻，從而影響細(xì)胞孕酮合成功能的下降或細(xì)胞活性下降，而細(xì)胞活性的下降可能也會(huì)影響細(xì)胞正常功能的發(fā)揮，最終導(dǎo)致生殖系統(tǒng)功能下降。下一步擬通過對(duì)孕酮合成途徑中某些關(guān)鍵蛋白及其mRNA表達(dá)水平的研究來探討AA毒性作用的具體機(jī)制，為闡明AA影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能的機(jī)理研究提供依據(jù)。

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Effect of Acrylamide on the Viability and Progesterone Biosynthesis Function of Rat R2C Leydig Cells

LI Mingwei1, SUN Jianxia2, XU Wei1, ZOU Feiyan1,*, BAI Shun1, ZHU Cuijuan1, HU Yunfeng1, JIAO Rui1,
WU Shi1, OU Shiyi1, FENG Mengge1, BAI Weibin1,*
(1. The First Affiliated Hospital, College of Life Science and Technology, Department of Food Science and Engineering, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Faculty of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Objective∶ To examine the effect of acrylamide (AA) on cell growth and progesterone synthesis in rat R2C cells. Methods∶ R2C cells were treated with AA at concentrations of 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4 and 6 mmol/L, respectively. Three inhibitory concentrations (IC25, IC50and IC75) were determined by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Cell morphology was observed after being sti mulated by the three inhibitory concentrations of AA for 24 h. DNA damage in R2C cells was measured by comet assay. The amounts of progesterone biosynthesis after being exposured to AA for 4 h and 24 h were detected by radioimmunoassay (RIA). Results∶ AA could inhibit the cell viability. The IC25, IC50and IC75were determined to be 1.140, 1.925 and 3.250 mmol/L, respectively. At these three concentrations, AA could affect cell morphology to different extends. DNA was significantly damaged at three concentrations of AA for 4 h, whereas the progesterone levels were significantly reduced after being exposed to AA for 24 h. Conclusion∶ AA can inhibit the cell growth and reduce the progesterone synthesis of R2C cells.

acrylamide; R2C cell; cell activity; DNA damage; progesterone

Q26

1002-6630（2015）17-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201517046

2015-04-16

廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（Yq2013024）；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目；

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201402；31201340）

李名薇（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯扯拘栽u(píng)價(jià)。E-mail：limingwei_2008@163.com

*通信作者：鄒飛雁（1963—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯撑c發(fā)育。E-mail：zoufeiyan6364@yahoo.com.cn

白衛(wèi)濱（1978—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與毒理安全性評(píng)價(jià)。E-mail：baiweibin@163.com