商 桑，王 健，丁曉雯*

赤霉素GA3急性毒性和遺傳毒性

商 桑，王 健，丁曉雯*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

目的：研究赤霉素GA3的急性毒性和遺傳毒性，為合理使用赤霉素以及赤霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。方法：采用最大劑量耐受法測(cè)定赤霉素GA3的急性毒性，采用蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)測(cè)定赤霉素GA3的遺傳毒性。結(jié)果：給昆明種小鼠經(jīng)口灌胃赤霉素GA3，LD50＞15 000 mg/kg；赤霉素GA3在質(zhì)量濃度為0.1～2.0 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，蠶豆根尖細(xì)胞微核率呈上升趨勢(shì)，與陰性對(duì)照組相比均存在極顯著差異，且微核指數(shù)均＞1.5；7.5 g/kg赤霉素GA3對(duì)雌、雄小鼠的骨髓細(xì)胞微核率分別為7.47‰、7.07‰，小鼠精子畸形率為5.47%，與陰性對(duì)照組相比均存在極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)論：赤霉素GA3的急性毒性雖然比較低，屬于無(wú)毒級(jí)，但是在較高劑量條件下對(duì)植物細(xì)胞、動(dòng)物的體細(xì)胞與生殖細(xì)胞均具有遺傳毒性，應(yīng)盡快制定赤霉素GA3使用限量標(biāo)準(zhǔn)。

赤霉素A3；急性毒性；遺傳毒性

赤霉素是一種生物活性高、應(yīng)用廣泛的植物激素類農(nóng)藥，具有促進(jìn)種子萌發(fā)、莖伸長(zhǎng)、葉片發(fā)育、花和果實(shí)發(fā)育等作用[1]，至今已發(fā)現(xiàn)100多種赤霉素，其中赤霉素GA3的生物活性最高、應(yīng)用最廣泛[2]。赤霉素GA3又名赤霉酸、“九二0”、“奇寶”，美國(guó)、日本等國(guó)家規(guī)定水果和蔬菜中赤霉素GA3的最高殘留限量為0.2 mg/kg[3]，而我國(guó)目前還未出臺(tái)相應(yīng)的農(nóng)產(chǎn)品限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前對(duì)赤霉素GA3的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的報(bào)道很少，也無(wú)赤霉素GA3導(dǎo)致人體中毒的報(bào)道，所以有必要對(duì)赤霉素GA3的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)（包括蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)）對(duì)赤霉素GA3的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為科學(xué)、合理地使用赤霉素GA3以及赤霉素GA3殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

蠶豆為優(yōu)質(zhì)小青皮豆，重慶當(dāng)?shù)禺a(chǎn)，當(dāng)年新種，購(gòu)于重慶市北碚區(qū)天生農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

SPF級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量25～30 g，重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0006。

赤霉素GA3（純度90%） 上海源葉生物公司；Giemsa染液 上海馨晟試化工科技有限公司；環(huán)磷酰胺山西普德藥業(yè)有限公司；小牛血清 廣州蕊特生物科技有限公司；甲醇、酚酞、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、伊紅、甘油等試劑均為分析純 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

XSN-3G型顯微鏡 重慶光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)[4]

采用最大耐受劑量法進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)：稱取7.500 g赤霉素GA3于研缽中，將其研磨成粉末狀，用蒸餾水定容至10 mL。選用昆明種小鼠雌、雄各10 只，每日給予小鼠最大灌胃劑量20 mL/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同）的赤霉素GA3，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.3.2 蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)[5]

將赤霉素GA3用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，設(shè)陰性對(duì)照組（蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺10 mg/L）、實(shí)驗(yàn)組（赤霉素GA30.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）。蠶豆于24 ℃蒸餾水中浸泡36 h，濕紗布包裹催芽36 h，選已發(fā)芽的蠶豆放入墊有濕脫脂棉的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)36 h，每12 h換水一次。選擇根芽整齊一致，根長(zhǎng)約1.0～1.5 cm的蠶豆隨機(jī)分組。每組隨機(jī)挑選6～8 粒發(fā)芽種子，置于盛放待測(cè)液的培養(yǎng)皿中浸泡4～6 h。處理后的種子用蒸餾水浸洗，再放入墊有濕脫脂棉的培養(yǎng)皿中回復(fù)培養(yǎng)24 h。切下1 cm根尖，用卡諾氏固定液（甲醇-冰乙酸（3∶1，V/V））固定24 h，放入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中4 ℃保存。常規(guī)制片，改良苯酚品紅染液染色，壓片鏡檢，每組觀察5 個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞，記錄含微核的細(xì)胞數(shù)，按公式（1）、（2）計(jì)算微核率及微核指數(shù)。

在陽(yáng)性對(duì)照組的微核率顯著增加，表示實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成立的情況下，若實(shí)驗(yàn)組的微核率與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，且微核指數(shù)≥1.5，則判斷赤霉素GA3可能具有致突變性[6]。

1.3.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)[7]

用蒸餾水配制3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的赤霉素GA3溶液，即高劑量組（1/2 LD50）、中劑量組（1/4 LD50）及低劑量組（1/8 LD50），并設(shè)陰性對(duì)照組（蒸餾水）及陽(yáng)性對(duì)照組（2 mg/mL環(huán)磷酰胺）。選用7～12 周齡，體質(zhì)量25～30 g的昆明種小鼠，每組10 只，雌雄各半。采用30 h給受試物法對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃，首次灌胃后間隔24 h第2次灌胃受試物，6 h后立即處死小鼠。取小鼠胸骨或股骨，按照GB 15193.5—2003《骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)》[7]中的方法制片及觀察。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，記錄含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，按公式（3）計(jì)算微核率。

1.3.4 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)[8]

用蒸餾水配制3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的赤霉素GA3，即高劑量組（1/2 LD50）、中劑量組（1/4 LD50）及低劑量組（1/8 LD50），并設(shè)陰性對(duì)照組（蒸餾水）及陽(yáng)性對(duì)照組（2 mg/mL環(huán)磷酰胺）。選用6～8 周齡，體質(zhì)量25～35 g的成年雄性小鼠，連續(xù)灌胃受試物5 d，每天1 次。首次給受試物35 d后處死小鼠，取出副睪，按照GB 15193.7—2003《小鼠精子畸形試驗(yàn)》[8]中的方法制片及觀察。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000 條完整精子，檢查精子頭部和尾部的形態(tài)是否異常，記錄精子畸形數(shù)，按公式（4）計(jì)算精子畸形率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知赤霉素GA3的急性毒性較小，因此采用最大耐受劑量法對(duì)其進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)。

將質(zhì)量濃度為0.75 g/mL的赤霉素GA3按照0.4 mL/20 g的最大灌胃劑量給予小鼠，連續(xù)觀察14 d，小鼠未出現(xiàn)死亡情況，也沒(méi)有任何中毒表現(xiàn)。表明赤霉素GA3對(duì)昆明種小鼠經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量＞15 g/kg，即LD50＞15 000 mg/kg。

2.2 蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 赤霉素GA3對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響Table1 Frequencies of micronucleus in Vicia ffaabbaa root tips exposed to

表1 赤霉素GA3對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響Table1 Frequencies of micronucleus in Vicia ffaabbaa root tips exposed to

注：**.與陰性對(duì)照組比較，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別質(zhì)量濃度/（mg/L）微核率/‰微核指數(shù)陰性對(duì)照組（蒸餾水）011.51±1.731.00陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺）1031.45±2.34**2.73實(shí)驗(yàn)組（赤霉素GA3）0.117.48±1.86**1.52 0.223.90±2.10**2.08 0.431.18±2.20**2.71 0.634.92±2.58**3.03 0.841.38±2.21**3.60 1.047.69±1.85**4.14 2.050.51±1.74**4.39

由表1可知，在赤霉素GA3質(zhì)量濃度為0.1～2.0 mg/L范圍內(nèi)，蠶豆根尖細(xì)胞微核率呈逐漸上升趨勢(shì)，與陰性對(duì)照組相比均存在極顯著差異（P＜0.01），且微核指數(shù)均＞1.5。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 正常及含微核的嗜多染紅細(xì)胞Fig.1 Normal polychromatic erythrocytes and polychromatic erythrocytes with micronucleus

由圖1可知，正常的嗜多染紅細(xì)胞較圓，呈淡紫色；而含微核的嗜多染紅細(xì)胞稍大，且在細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)深紫色的微核，微核直徑約為細(xì)胞直徑的1/10。

表2 赤霉素GA3對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響Table2 Frequencies of micronucleus in polychromatic erythrocytesTable2 Frequen exposed to GA o GA3

表2 赤霉素GA3對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響Table2 Frequencies of micronucleus in polychromatic erythrocytesTable2 Frequen exposed to GA o GA3

小鼠性別組別灌胃劑量/（g/kg）微核率/‰雄性陰性對(duì)照組3.07±0.55陽(yáng)性對(duì)照組0.04022.93±1.52**赤霉素GA3低劑量組1.8753.13±0.45赤霉素GA3中劑量組3.7503.67±0.62赤霉素GA3高劑量組7.5007.07±0.92**雌性陰性對(duì)照組2.93±0.55陽(yáng)性對(duì)照組0.04022.53±0.84**赤霉素GA3低劑量組1.8753.20±0.65赤霉素GA3中劑量組3.7503.80±0.77赤霉素GA3高劑量組7.5007.47±1.10**

由表2可知，陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比存在極顯著差異（P＜0.01），證明此條件下所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。對(duì)于雄性小鼠，赤霉素GA3低、中、高劑量組的微核率分別為3.13‰、3.67‰、7.07‰，且赤霉素GA3高劑量組與陰性對(duì)照組相比存在極顯著差異（P＜0.01）。對(duì)于雌性小鼠，赤霉素GA3低、中、高劑量組的微核率分別為3.20‰、3.80‰、7.47‰，且赤霉素GA3高劑量組與陰性對(duì)照相比存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.4 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 赤霉素GA3對(duì)小鼠精子畸形率的影響TTaabbllee 33 FFrequencies of mice sperm abnormality exposed to GA3

表3 赤霉素GA3對(duì)小鼠精子畸形率的影響TTaabbllee 33 FFrequencies of mice sperm abnormality exposed to GA3

組別灌胃劑量/（g/kg）精子畸形率/%陰性對(duì)照組4.26±0.24陽(yáng)性對(duì)照組0.0409.32±0.49**赤霉素GA3低劑量組1.8754.39±0.38赤霉素GA3中劑量組3.7504.60±0.39赤霉素GA3高劑量組7.5005.47±0.42**

由表3可知，陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠精子畸形率分別為4.26%、9.32%，兩者之間存在極顯著差異，故認(rèn)為此條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。赤霉素GA3低、中、高劑量組的小鼠精子畸形率分別為4.39%、4.60%、5.47%，且赤霉素GA3高劑量組與陰性對(duì)照組相比存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 小鼠精子畸形類型及畸形數(shù)Fig.2 Types of sperm abnormality of mice exposed to GA3

由圖2可知，赤霉素GA3各劑量組對(duì)小鼠精子畸形類型的影響以無(wú)定形為主，其次為尾折疊、香蕉形、無(wú)鉤、胖頭、小頭，而雙頭、雙尾較少。

3 結(jié)論與討論

急性毒性是食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序的第一階段，是指經(jīng)口一次性給予或24 h內(nèi)多次給予受試物后，動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，包括致死和非致死的指標(biāo)參數(shù)，致死劑量常用半數(shù)致死量LD50表示[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，赤霉素GA3對(duì)昆明種小鼠經(jīng)口最大耐受劑量＞15 g/kg，即LD50＞15 000 mg/kg，急性毒性較低。但有研究表明，赤霉素GA3對(duì)動(dòng)物的肝臟功能會(huì)產(chǎn)生一定影響[9-13]，能促進(jìn)鼠仔出生后的生長(zhǎng)發(fā)育[14]，有神經(jīng)毒害作用[15]，還會(huì)增加患皮膚炎癥和膀胱疾病的機(jī)率[16]。

蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性的方法。由于蠶豆根尖細(xì)胞在分裂時(shí)受到外界誘變因子的作用而產(chǎn)生不隨細(xì)胞分裂進(jìn)入細(xì)胞核的染色體小片段，可根據(jù)微核指數(shù)初步判斷受試物是否具有致突變性及誘變嚴(yán)重程度[17]。因這種方法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高，且檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致等優(yōu)點(diǎn)，在致突變性的檢測(cè)方面得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)應(yīng)用范圍已從最初的水環(huán)境[18]迅速擴(kuò)展到食品[19]、藥物[20]等復(fù)雜體系中致突變物的檢測(cè)。已有文獻(xiàn)表明赤霉素GA3有致癌性[21-25]和致畸性[26]。而本實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)0.1～2.0 mg/L赤霉素GA3處理的蠶豆根尖細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組存在極顯著差異，且微核指數(shù)均＞1.5，初步判定赤霉素GA3可能具有致突變性。

小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)是一種通過(guò)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率以評(píng)價(jià)細(xì)胞遺傳損傷的體內(nèi)微核實(shí)驗(yàn)。紅細(xì)胞受到外界誘變因子的作用可形成微核[27]。本實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比，高質(zhì)量濃度的赤霉素GA3（7.5 g/kg）誘導(dǎo)的骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率具有極顯著差異（P＜0.01），表明赤霉素GA3對(duì)雌、雄小鼠體細(xì)胞均具有一定的遺傳毒性。

小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)是一種通過(guò)觀察精子形態(tài)變化以檢測(cè)環(huán)境因子對(duì)生殖細(xì)胞致突變作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。已知精子的畸形是精子基因突變的結(jié)果，因此精子形態(tài)的改變表明有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物發(fā)生了變化[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，赤霉素GA3高劑量組（7.5 g/kg）的小鼠精子畸形率存在極顯著差異（P＜0.01），表明赤霉素GA3對(duì)小鼠生殖細(xì)胞具有一定的遺傳毒性。赤霉素GA3對(duì)小鼠精子畸形類型的影響以無(wú)定形為主，其次為尾折疊、香蕉形、無(wú)鉤、胖頭、小頭，而雙頭、雙尾則較少。

赤霉素GA3的急性毒性雖然較低，屬于無(wú)毒級(jí)，但是在較高劑量（7.5 g/kg）條件下對(duì)植物細(xì)胞、動(dòng)物的體細(xì)胞與生殖細(xì)胞都具有遺傳毒性，應(yīng)盡快制定赤霉素使用限量標(biāo)準(zhǔn)，以保證廣大消費(fèi)者的健康。

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Acute Toxicity and Genetic Toxicity of Gibberellin A3

SHANG Sang, WANG Jian, DING Xiaowen*(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Purpose∶ To examine the acute toxicity and genotoxicity of gibberellin A3(GA3), which can provide scientificsupport for the reasonable use of GA3and a reference for establishing maximum residue limit (MRL) for GA3. Methods∶Acute toxicity was examined by using the maximum tolerated dose method while genotoxicity was examined usingViciamicronucleus test, bone marrow cell micronucleus test and sperm abnormality test in mice. Results∶ The acute oral LD50ofGA3in Kunming mice was > 15 000 mg/kg. As GA3concentration increased from 0.1 to 2.0 mg/L, the micronucleus rate ofVicia fabaroot tip cells showed a rising trend, which indicated a highly significant difference compared to negative controlsand the micronucleus index remained higher than 1.5 at all investigated GA3concentrations. The bone marrow micronucleusrates of male and female mice treated with 7.5 g/kg GA3were 7.47‰and 7.07‰, respectively, and the sperm malformationrate of mice was 5.47%, which revealed highly significant differences compared to that of negative controls (P＜ 0.01).Conclusion∶ Although GA3with low acute toxicity can be considered as a non-toxic substance, it causes genotoxicity to plantcells and animal somatic and germ cells at high doses. The MRL for GA3should be set up as early as possible.

gibberellin A3; acute toxicity; genotoxicity

TS201.6

A

10.7506/spkx1002-6630-201517044

2014-09-18

重慶市科委重點(diǎn)課題（cstc2013yykfB0165）

商桑（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：gksl612susan@yeah.net

*通信作者：丁曉雯（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：xiaowend@sina.com