陳敬幫，周銀華，趙新宇,2，陳守文，魏雪團(tuán),2,*

α-淀粉酶在不同地衣芽孢桿菌宿主菌中分泌表達(dá)的對比分析

陳敬幫1，周銀華1，趙新宇1,2，陳守文1，魏雪團(tuán)1,2,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

研究不同地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）宿主菌對α-淀粉酶分泌表 達(dá)的影響。以Bacillus subtilis的P43啟動子，B. licheniformisWX-02α-淀粉酶基因的信號肽、編碼區(qū)和終止子序列為表達(dá)原件，構(gòu)建了α-淀粉酶分泌表達(dá)載體pP43SAT。將pP43SAT分別轉(zhuǎn)入3株B. licheniformis宿主菌：WX-02（ΔamyL）、BL9和BL10，獲得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02（ΔamyL，pP43SAT）、BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并將構(gòu)建的3株工程菌進(jìn)行發(fā)酵對比分析。BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）的淀粉酶發(fā)酵活力分別達(dá)到94.01 U/mL和101.94 U/mL，比原始宿主菌WX-02（ΔamyL，pP43SAT）分別提高了21%和31%，這說明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表達(dá)。本研究證明多蛋白酶基因缺失可顯著提高α-淀粉酶的表達(dá)，為α-淀粉酶的高效表達(dá)提供了新型宿主菌和新策略。

α-淀粉酶；地衣芽孢桿菌；宿主菌；分泌表達(dá)

α-淀粉酶可水解淀粉，產(chǎn)生糊精、低聚糖和單糖，在食品、醫(yī)藥和紡織品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]?；蚬こ碳夹g(shù)常用來提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量，李金霞等[3]通過大腸桿菌宿主菌實(shí)現(xiàn)了α-淀粉酶的表達(dá)，但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)易形成包涵體，且外膜含有對人和動物有毒性的內(nèi)毒素脂多糖，產(chǎn)物分離純化比較困難[4]。相比之下，地衣芽孢桿菌為食品級微生物，具有較高的安全性，且最適生長溫度高，生長速度快，細(xì)胞壁組成簡單，蛋白分泌能力強(qiáng)[5]。王鳳寰等[6]通過同源整合技術(shù)，構(gòu)建了含透明顫菌血紅蛋白基因的地衣芽孢桿菌宿主菌，顯著提高了α-淀粉酶的發(fā)酵活性。牛丹丹等[7]采用同源介導(dǎo)α-淀粉酶基因擴(kuò)增技術(shù)，提高了基因拷貝數(shù)，顯著提高了α-淀粉酶的發(fā)酵活性。楊艷華等[8]通過過量表達(dá)調(diào)控基因degQ，顯著提高了α-淀粉酶的表達(dá)水平。Ghang等[9]選擇不同釀酒酵母表達(dá)α-淀粉酶基因，最大淀粉酶活性提高了10倍，而Galdino等[10]發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶在釀酒酵母中的表達(dá)活力僅為3.93 U/mL。由此可見，宿主菌對外源蛋白的表達(dá)影響很大，宿主菌的改造對α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要。

宿主菌的胞外蛋白酶可降解目標(biāo)蛋白，從而降低目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。因此，缺失其胞外蛋白酶可能抑制目標(biāo)蛋白的降解，從而提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。Ignatova等[11]采用不同的大腸桿菌宿主菌表達(dá)青霉素?；?，發(fā)現(xiàn)多蛋白酶基因缺失可顯著提高青霉素?；傅谋磉_(dá)量。Nguyen等[12]利用8蛋白酶基因缺失的枯草芽孢桿菌WB800為宿主菌，顯著提高了納豆激酶的表達(dá)量。WX-02為本課題組前期篩選的一株地衣芽孢桿菌[13]，可高產(chǎn)聚谷氨酸[14-15]、2,3-丁二醇[16]和乙偶姻[17]，在WX-02的基礎(chǔ)上，通過疊加敲除的手段分別構(gòu)建了多蛋白酶基因缺失的新型宿主菌，前期研究結(jié)果證實(shí)多基因缺失宿主菌可顯著提高納豆激酶的表達(dá)量[18]。多蛋白酶基因缺失的宿主菌還未應(yīng)用于α-淀粉酶的表達(dá)，無法理解宿主菌蛋白酶缺失對α-淀粉酶的影響，阻礙該策略在α-淀粉酶表達(dá)中的應(yīng)用。本研究以前期構(gòu)建的多基因缺失宿主菌BL9和BL10為宿主菌進(jìn)行α-淀粉酶的分泌表達(dá)，評價(jià)多蛋白酶基因缺失對α-淀粉酶表達(dá)的影響，為α-淀粉酶的高效表達(dá)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株

表1為實(shí)驗(yàn)所用菌株。其中BL9缺失7個(gè)蛋白酶基因（mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL）和1個(gè)鞭毛蛋白基因（hag），同時(shí)為了排除自身基因組中α-淀粉酶基因?qū)Ζ?淀粉酶表達(dá)的影響，還缺失了α-淀粉酶基因（amyL），BL10是在BL9的基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除了蛋白酶基因bprA。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株Table1 A list of the strains used in this study

1.1.2試劑

DNA聚合酶、dNTPs、各種DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、RNA酶、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker、DNA Marker日本TaKaRa公司；DNA回收試劑盒 武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司；瓊脂糖 法國Biowest公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、四環(huán)素（tetracycline，Tet）、蛋白膠配制所需試劑 美國Sigma公司；其他主要生化試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L。

芽孢桿菌感受態(tài)制備培養(yǎng)基：生長培養(yǎng)基為含0.5 mol/L山梨醇的LB培養(yǎng)基；洗滌培養(yǎng)基為0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10%甘油；恢復(fù)培養(yǎng)基為含0.5 mol/L山梨醇和0.38 mol/L甘露醇的LB培養(yǎng)基。

淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿干粉5 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、檸檬酸鈉12 g/L、K2HPO4·H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl2·2H2O 0.15 g/L，pH 7.0～7.2。

抗生素質(zhì)量濃度：大腸桿菌克隆篩選和培養(yǎng)使用Amp質(zhì)量濃度為100μg/mL；芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子篩選使用Tet質(zhì)量濃度為20μg/mL，重組菌株的培養(yǎng)使用Tet質(zhì)量濃度為25μg/mL。

1.2儀器與設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司；GenePulserTM電脈沖轉(zhuǎn)化儀 美國Bio-Rad公司；HQL300B恒溫大幅振蕩搖床 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；高壓滅菌鍋 日本三洋公司；電子分析天平（萬分之一）德國Sartorius Analytic公司。

1.3方法

1.3.1α-淀粉酶分泌表達(dá)載體構(gòu)建

α-淀粉酶分泌表達(dá)載體構(gòu)建參考本課題組先前報(bào)道的方法[19]，構(gòu)建步驟如圖1所示。根據(jù)B. licheniformisWX-02基因組序列中的amyL基因序列（MUY_00877），設(shè)計(jì)一對引物PamyLF1（5’-GAGAGGAATGTACA CATGAAATGAAACAACAAAAACGGCTT-3’）和PamyTR（5’-GAAGATCTCGCAATAATGCCGTCGCAC TG-3’），以B. licheniformisWX-02的總DNA為模板，聚合酶鏈 式反應(yīng)（polymerase chain rea ction，PCR）擴(kuò)增得到α-淀粉酶基因的編碼區(qū)（包括信號肽）片段和終止子片段amyL+TamyL，長度約2 040 bp。 根據(jù)B. subtilis168基因組上P43啟動子的序列設(shè)計(jì)一對引物P43F（5’-GG AATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’）和P43R1（5’-AAGCCGTTTTTGTTGTTTCATTTCATGTGTACA TTCCTCTC-3’），PCR擴(kuò)增得到啟動子P43片段，長度約305 bp，將這兩個(gè)片段經(jīng)DNA純化試劑盒純化回收后作為模板，用重疊延伸PCR法（splicing overlap extension PCR，SOE-PCR）連接在一起，得到片段SAT，總長度約2 345 bp，純化回收后，用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切，純化回收片段SAT。然后將pHY300PLK空質(zhì)粒用同樣的酶雙酶切，純化回收后與前面得到的片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證、質(zhì)粒抽提和雙酶切驗(yàn)證，獲得的重組α-淀粉酶分泌表達(dá)質(zhì)粒命名為pP43SAT，長度約4 870 bp。

圖 1 1 α-淀粉酶表達(dá)載體pP43SAT的構(gòu)建過程Fig.1 Construction process of α-amylase expression vector (pP43SAT)

1.3.2α-淀粉酶重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

重組表達(dá)菌株參考本課題組先前報(bào)道的方法構(gòu)建[18]。分別接種B. licheniformisBL9和BL10于LB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至電轉(zhuǎn)化生長培養(yǎng)基中，250 r/min、37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.8～0.9，冰浴10 min，5 500 r/min離心6 m in，收集菌體，用電轉(zhuǎn)化洗滌培養(yǎng)基洗滌菌體3次，重懸于洗滌培養(yǎng)基中，即為感受態(tài)細(xì)胞。取感受態(tài)細(xì)胞加入5μLpP43SAT質(zhì)粒DNA（50 ng/μL），轉(zhuǎn)至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯（0.2 cm）中，冰浴1～1.5 min，用電脈沖轉(zhuǎn)化儀2.5 kV電擊1次，迅速加900μL電轉(zhuǎn)化恢復(fù)培養(yǎng)基，37℃水浴1 h，100 r/min恢復(fù)培養(yǎng)2 h，涂含有20μg/mL的四環(huán)素抗性平板，37℃培養(yǎng)20 h，挑取轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證、質(zhì)粒抽提驗(yàn)證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，通過該方法構(gòu)建重組表達(dá)菌株B. licheniformisBL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并構(gòu)建含有空質(zhì)粒pHY300PLK的對照表達(dá)菌株。

1.3.3重組發(fā)酵菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

將B. licheniformisBL9（pP43SAT），BL10（pP43SAT）和對照菌株接種于5 mL的含四環(huán)素（20μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。再以4%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，直到OD600nm為1.0時(shí)，以1%的接種量接種到50 mL新鮮的淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔4 h取樣一次，測定 其OD600nm和淀粉酶活力，取發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，鑒定淀粉酶的表達(dá)。

1.3.4表達(dá)蛋白的鑒 定

取0.9 mL發(fā)酵上清液，加入0.1 mL 100 g/100 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，顛倒10次混勻，4℃過夜放置，13 000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.2 mL無水乙醇洗滌，13 000 r/min離心10 min，棄上清，依此重復(fù)洗滌3次，37℃吹干，加入30μL包含8 mol/L尿素和2 mol/L硫脲的溶液溶解蛋白 樣品，再加入30μL2×SDS-PAGE上樣緩沖液和3μL1 mol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），100℃水浴10 min溶解沉淀。SDS-PAGE凝膠參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行配制[20]。將溶解好的蛋白離心后取20μL上樣，用80 V的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑從濃縮 膠進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)到120 V，繼續(xù)電泳直到溴酚藍(lán)指示劑抵達(dá)分離膠底部，斷開電源停止電泳。電泳結(jié)束后，于考馬斯亮藍(lán)R250染色液 中處理1～2 h，最后于脫色液中處理數(shù)次直至條帶清晰。

1.3.5α-淀粉酶活力測定

發(fā)酵液經(jīng)1 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋即為待測樣品。吸取20.0 mL 2 g/mL可溶性淀粉溶液于50 mL離心管中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）搖勻后置于60℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱8 min。加入1 mL待測樣品，搖勻，反應(yīng)10 min。吸取1.00 mL反應(yīng)液至預(yù)先盛有0.5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和5 mL稀碘液的離心管中，搖勻，并以0.5 mL鹽酸溶液和5 mL稀碘液為空白，在660 nm波長處迅速測定其吸光度（A）。淀粉酶活力單位為U/mL，1 U定義為：在60℃、pH 6.0的條件下1 min水解1 mg淀粉所需的酶量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1α-淀粉酶表達(dá)質(zhì)粒pP43SAT的構(gòu)建

以設(shè)計(jì)在pHY300PLK載體上PHY-F/PHY-R為引物，通過菌落PCR初步挑選陽性克隆子。挑取候選陽性克隆子過夜培養(yǎng)，抽質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，pP43SAT質(zhì)粒經(jīng)過BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切后，得到片段大小約為4 870 bp和2 345 bp的兩個(gè)片段，分別與空質(zhì)粒pHY300PLK和片段SAT大小相等，說明pP43SAT質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 表達(dá)質(zhì)粒pP43SAT的酶切鑒定Fig.2 Identification of expression vector pP43SAT by restriction enzyme digestion

2.2α-淀粉酶表達(dá)蛋白鑒定

圖3 不同基因工程菌胞外蛋白的SDS-PAGE圖譜分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of extracellular proteins from different genetically engineered strains

將構(gòu)建好的α-淀粉酶表達(dá)載體pP43SAT分別轉(zhuǎn)入BL9和BL10，得到工程菌株BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并在BL10中轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pHY300P LK得到對照菌BL10（pHY300PLK），抽質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過液體發(fā)酵，取發(fā)酵24 h時(shí)的發(fā)酵液樣品，在相同條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。與空白對照相比，BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）菌株發(fā)酵液中含有強(qiáng)烈的α-淀粉酶條帶，大小約58 kD，與先前報(bào)道的B. licheniformis α-淀粉酶的分子質(zhì)量相一致[22]，說明α-淀粉酶在BL9和BL10中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。從α-淀粉酶條帶強(qiáng)度可以看出，BL10宿主菌具有更高的α-淀粉酶表達(dá)量。BL10是在BL9的基礎(chǔ)上敲除了bprA基因，說明宿主菌缺失蛋白酶BprA可進(jìn)一步提高α-淀粉酶的表達(dá)。

2.3不同宿主菌對α-淀粉酶發(fā)酵過程的影響

圖4 不同宿主菌對α-淀粉酶發(fā)酵過程的影響Fig.4 Effects of different host strains on the fermentation process of α-amylase

為了對比BL9、BL10和野生菌WX-02的α-淀粉酶表達(dá)效果，并排除B. licheniformis自身α-淀粉酶對蛋白表達(dá)的影響，將pP43SAT表達(dá)載體轉(zhuǎn)入缺失α-淀粉酶基因的WX-02（ΔamyL）宿主菌中，構(gòu)建了B. licheniformisWX-02（ΔamyL，pP43SAT）。WX-02（ΔamyL，pP43SAT）、BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）的淀粉酶發(fā)酵過程如圖4所示。與WX-02（ΔamyL，pP43SAT）相比，BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）菌體生長相對緩慢，最終生物量微弱下降（圖4A），這可能是由于BL9和BL10菌株分別缺失9個(gè)和10個(gè)基因，對菌體的生長具有微弱的損傷作用，這與本課題先前發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相似[18]。

微弱降低的菌體量并沒有降低淀粉酶的表達(dá)量，如圖4B所示，BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）淀粉酶發(fā)酵活力分別達(dá)到94.01 U/mL和101.94 U/mL，比WX-02（ΔamyL，pP43SAT）的發(fā)酵活力（77.88 U/mL）提高了21%和31%，這說明BL9和BL10新型宿主菌有利于α-淀粉酶的表達(dá)，這與先前報(bào)道的納豆激酶變化趨勢相符合[18]。B. licheniformis宿主菌缺失蛋白酶基因后，可降低自身蛋白酶對目標(biāo)蛋白的降解作用，這可能是淀粉酶表達(dá)活性增加的原因。同時(shí)，BL10（pP43SAT）的α-淀粉酶表達(dá)活性相對于BL9（pP43SAT）提高了8%，這與SDS-PAGE的蛋白質(zhì)濃度變化趨勢相一致，進(jìn)一步說明BprA蛋白酶的缺失有利于α-淀粉酶的表達(dá)。

3 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了α-淀粉酶表達(dá)載體pP43SAT，實(shí)現(xiàn)了α-淀粉酶在地衣芽孢桿菌宿主菌WX-02（ΔamyL）、BL9和BL10中的成功表達(dá)。與宿主菌WX-02（ΔamyL）相比，BL9和BL10可顯著提高α-淀粉酶的表達(dá)，分別提高了21%和31%。目前，以枯草芽孢桿菌蛋白酶缺失株為宿主表達(dá)外源蛋白的研究較多，如6蛋白酶缺失株B. subtilisWB600可高效表達(dá)納豆激酶[23]和枯草蛋白酶[24]，8蛋白酶缺失株B. subtilisWB800可高效表達(dá)木聚糖酶[25]和磷脂酶C[26]，而多蛋白酶缺失的地衣芽孢桿菌宿主菌報(bào)道較少，本課題組前期證明BL10有利于納豆激酶的表達(dá)，本研究證明胞外蛋白酶基因缺失可顯著提高α-淀粉酶的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)多蛋白酶缺失宿主菌的應(yīng)用價(jià)值。更重要的是，本研究為α-淀粉酶的增強(qiáng)表達(dá)提供了新的思路，提供了一種高效表達(dá)α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌工程菌BL10（pP43SAT），相信經(jīng)過進(jìn)一步的發(fā)酵工藝優(yōu)化和中試放大研究，該菌株有望應(yīng)用于α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

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Comparative Analysis on the Effects of Different Host Strains of Bacillus licheniformis on the Expression and Secretion of α-Amylase

CHEN Jingbang1, ZHOU Yinhua1, ZHAO Xinyu1,2, CHEN Shouwen1, WEI Xuetuan1,2,*
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In the present study, effects of different host strains ofBacillus licheniformison the expression and secretion ofα-amylase were investigated. Firstly, theα-amylase expression vector, named pP43SAT, was constructed based on the promoter P43 fromBacillus subtilisand the signal peptide, coding region and terminator ofα-amylase gene fromB. licheniformisWX-02. The pP43SAT plasmids were then transformed into theB. licheniformishost strains WX-02 (ΔamyL), BL9 and BL10B, respectively, to obtain theα-a mylase genetic engineering strainsWX-02 (ΔamyL;pP43SAT), BL9 (pP43SAT) and BL10 (pP43SAT), respectively. Theα-amylase fermentation processes of these engineered strains were compared.Theα-amylase activities ofstrains BL9 (pP43SAT) and BL10 (pP43SAT) reached 94.01 and 101.94 U/mL, respectively, which were increased by 21% and 31%, respectively, as compared with that of WX-02 (ΔamyL;pP43SAT). These results showed that the novel host strains BL9 and BL10 contributed to the secretion and expression ofα-amylase. It was proved that the deletion of multiple proteases genes could enhanceα-amylase expression obviously, and this st udy provided the novel host strains and novel strategies for efficient expression ofα-amylase.

α-amylase;Bacillus licheniformis; host strain;secretion and expression

Q812

1002-6630（2015）17-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201517037

2015-04-10

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014CFB943）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2662015QC035）

陳敬幫（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称访笇W(xué)。E-mail：1176154594@qq.com

*通信作者：魏雪團(tuán)（1984—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn