楊吉霞，張利玲，蔣厚陽，賀稚非*

眉山泡菜中乳酸菌的分離鑒定

楊吉霞，張利玲，蔣厚陽，賀稚非*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，重慶 400715）

目的：分析眉山泡菜的基本數(shù)據(jù)和乳酸菌的菌種構(gòu)成。方法：從眉山市采集泡菜12 份，測定pH值、總酸度、鹽度、乳酸菌計數(shù)，用16S rRNA序列分析法鑒定菌種。結(jié)果：樣品pH值的范圍是3.37～3.89，總酸度的范圍是0.65～0.92 g/100 g（以乳酸計），鹽度的范圍是4.16%～5.28%（以NaCl計），MRS和M17乳酸菌計數(shù)分別是1.71～6.33、1.33～5.78（lg（CFU/g））?？偹岫葘θ樗峋嫈?shù)影響最大。共分離鑒定出16 株乳酸菌：Lactobacillus fermentum（2 株）、Lactobacillus plantarum（3 株）、Lactobacillus brevis（2 株）、Lactobacillus acidophilus（1 株）、Lactobacillus casei（1 株）、Lactobacillus pentosus（1 株）、Lactobacillus delbrueckii（1 株）、Lactococcus lactis（3 株）、Pediococcus pentosaceus（2 株）。結(jié)論：眉山泡菜中乳酸菌存在多樣性，實驗結(jié)果為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)泡菜積累了菌株。

泡菜；乳酸菌；16S rDNA序列分析

doi∶10.7506/spkx1002-6630-201517030

眉山市有得天獨厚的自然條件，岷江和青衣江縱貫全境，土壤肥沃，是重要的蔬菜生產(chǎn)基地，也是四川泡菜重要的發(fā)源地，有近4 000a制作泡菜的歷史，被授予“中國泡菜之鄉(xiāng)”的稱號[1-2]。

泡菜的制作是將新鮮蔬菜洗凈，裝入泡菜壇密封，浸漬在食鹽水中厭氧發(fā)酵，食鹽水的作用是將蔬菜汁液滲出，自然環(huán)境中的乳酸菌利用汁液中的可溶性成分（主要是糖類和含氮物質(zhì)）代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)和風味成分，賦予泡菜獨特的酸脆鮮香風味[3-4]。泡菜中蘊藏著豐富的天然乳酸菌，它們對于泡菜風味品質(zhì)的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時乳酸菌也是益生菌，對人體健康有多種保健功效。陳功[5]、汪紅[6]、王柱[7]等對四川泡菜中的乳酸菌進行了比較系統(tǒng)的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)地區(qū)、氣候環(huán)境、制作習慣等都會造成乳酸菌菌種構(gòu)成的差異，總的來說，還需要開展更多更廣泛的分離鑒定工作，以拓展對乳酸菌多樣性的認識，積累豐富的菌種資源，為豐富工業(yè)菌種和益生菌種奠定基礎。

本研究以眉山市的各種泡菜作為樣品，對其中的乳酸菌進行分離、純化和鑒定，分析菌種構(gòu)成的多樣性，為泡菜發(fā)酵產(chǎn)業(yè)積累菌種。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

1.1.1 樣品

從眉山市各個地區(qū)采集泡菜樣品12 份，其中泡豇豆樣品7 份，編號為D1～D7，泡蘿卜樣品5 份，編號為L1～L5，樣品裝入冰盒中迅速帶回實驗室，具體信息見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[8]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、K2HPO42 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 6.6，121 ℃滅菌15 min。

M17固體培養(yǎng)基[9]：胰蛋白胨5.0 g、牛肉膏5.0 g、大豆蛋白胨5.0 g、酵母浸膏2.5 g、抗壞血酸0.5 g、硫酸鎂0.25 g、磷酸甘油二鈉19.0 g、乳糖5 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

異硫氰酸胍、溶菌酶、蛋白酶K、乙二胺四乙酸鈉（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、Tris、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；TaqDNA酶、dNTP、10×PCR Buffer、MgCl2日本TaKaRa公司；瓊脂糖、Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker、100 bp DNA Ladder Ⅱ、1 kb DNA Marker Ⅰ、6×Loading Buffer（DNA） 上海鼎國生物技術(shù)有限公司；其余化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

2.5 L C-1厭氧產(chǎn)氣袋、2.5 L C-31厭氧培養(yǎng)罐 日本三菱公司；JYD-400拍擊式均質(zhì)器 上海之信儀器有限公司；SIM-F140AY65型制冰機 上海三洋電機國際貿(mào)易有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；1-15PK臺式離心機 德國Sigma實驗室離心機公司；Biospec-mini型島津DNA/RNA/蛋白質(zhì)分析裝置 日本島津制作所；S1000伯樂高性能聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、164-5050伯樂基礎電源電泳儀 美國Bio-Rad公司；Syngene GeneGenius凝膠成像系統(tǒng) 美國基因生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品基本指標測定

樣品的pH值按照GB/T 10468—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》測定；總酸度按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定，結(jié)果以乳酸計；鹽度按照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》方法測定，結(jié)果以NaCl計。以上實驗都做3 次平行測定。

乳酸菌計數(shù)：稱取10 g泡菜樣品放入均質(zhì)袋內(nèi)，加入90 mL無菌生理鹽水，用均質(zhì)器處理1 min，使泡菜表面的細菌充分進入到生理鹽水中，即得10-1的樣品稀釋液，再用生理鹽水稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5倍，分別取每個倍數(shù)稀釋液1 mL于培養(yǎng)皿中，加入滅菌后保溫于45 ℃的MRS或M17培養(yǎng)基，混勻凝固后倒置，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，重復計數(shù)3 次。

各泡菜樣品基本指標的測定結(jié)果用IBM SPSS Statistics 19.0做相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗用Pearson’s法。

1.3.2 乳酸菌的分離純化和初步鑒定

取1.3.1節(jié)乳酸菌計數(shù)中制備的各梯度稀釋液0.2 mL涂布于MRS和M17培養(yǎng)基，同樣條件下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落形態(tài)：顏色、形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度等，用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的菌落，于MRS或M17培養(yǎng)基上劃線分離3～4 次直至純化為單菌落。在超凈工作臺內(nèi)，挑取單菌落做過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色實驗，過氧化氫酶陰性和革蘭氏染色陽性者初步判斷為乳酸菌。菌株于-80 ℃冷凍保存于含有體積分數(shù)15%甘油的MRS或者M17培養(yǎng)液中。

1.3.3 乳酸菌的菌種鑒定

將待測菌株用MRS或者M17液體培養(yǎng)基連續(xù)活化2 次，再用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取1 mL菌液按照本實驗室建立的異硫氰酸胍法[10]提取基因組DNA。配制0.8g/100 mL瓊脂糖凝膠，取10μL基因組DNA點樣，用Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker作為參照，然后在90 V電壓下電泳40～50 min，用凝膠成像儀觀察拍照，目標片段應在23 000 bp[11]附近。

對所提取的基因組DNA進行16S rDNA片段擴增，采用細菌16S rDNA基因的通用引物[12]，正向引物為27F（5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’），反向引物為1541R（5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’）。50μL PCR反應體系為：10×PCR Buffer 5.0μL、10 mmol/L dNTP 1μL、2.5 mmol/L MgCl25.0μL、10μmol/L引物1.0μL、Taq酶2 U、DNA模板2.0μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物約1 500 bp[10]，用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司做雙向測序。

將測序結(jié)果采用DNAMAN軟件雙向拼接，用比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）軟件登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）網(wǎng)站與GenBank中已知序列進行同源性分析。一般來講，在種分類等級上，如果2 個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%，則認為屬于同一個種[12]。并在標準菌株網(wǎng)站（http∶//www.straininfo.net/）中尋找合適的標準菌株序列，使用MEGA 5軟件包將標準序列與實驗序列以Clustal W進行序列比對后，采用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的基本指標

表1 眉山泡菜樣品的基本指標Table1 Chemical indexes and LAB counts of pickled vegetable samples collected from Meishan city

表2 眉山泡菜樣品基本指標之間的相關(guān)性Table2 Correlation among chemical indexes and LAB counts of Meishan pickle samples

表1列出了樣品的pH值、總酸度、鹽度和乳酸菌計數(shù)。表2為5 項基本指標之間的相關(guān)性分析，結(jié)果表明總酸度與pH值之間顯著負相關(guān)，樣品的pH值越低，總酸度越高，MRS培養(yǎng)基乳酸菌計數(shù)和M17培養(yǎng)基乳酸菌計數(shù)與總酸度之間均為極顯著負相關(guān)，即總酸度越高，乳酸菌計數(shù)越小，可見總酸度是對乳酸菌計數(shù)影響最大的因素，MRS培養(yǎng)基乳酸菌計數(shù)和M17培養(yǎng)基乳酸菌計數(shù)之間極顯著正相關(guān)。

由表1可知，7 份泡豇豆樣品的MRS培養(yǎng)基乳酸菌計數(shù)為105～106CFU/g，M17培養(yǎng)基乳酸菌計數(shù)為104～105CFU/g，明顯高于5 份泡蘿卜樣品的乳酸菌計數(shù)（10～103CFU/g和10～102CFU/g）?？赡苡幸韵聝蓚€方面的原因：一是泡蘿卜樣品的可滴定酸的含量相對較高，從上述分析得出總酸度對乳酸菌計數(shù)影響最大，所以乳酸菌數(shù)量較少；二是生蘿卜中含有辣味成分4-甲硫基-3-丁烯異硫氰酸鹽，有抑菌活性[13-15]，鹽腌制后辣味物質(zhì)的降解產(chǎn)物也有抗菌活性[16-18]，抗菌成分有可能使乳酸菌的可培養(yǎng)性降低。

2.2 乳酸菌的菌落、菌體形態(tài)特征

表3 菌株形態(tài)及鏡檢結(jié)果Table3 Colony morphology and micro-morphology of isolated strains

續(xù)表3

從12 份泡菜樣品中總共分離出16 株菌，表3列出了鏡檢結(jié)果，可知其中有桿菌11 株，球菌5 株，革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫酶反應均為陰性，由此初步判斷分離得到的16 株菌均為乳酸菌。

2.3 乳酸菌基因組DNA凝膠電泳

將16 株乳酸菌所提基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像儀照相并觀察，結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA extracted from lactic acid bacteria strains

如圖1所示，在23 130 bp處出現(xiàn)熒光條帶而且無明顯拖尾現(xiàn)象，說明各菌株有DNA提出且純度較好。各條帶亮度不同，說明各菌株提出的DNA濃度不同，但都能滿足后續(xù)16S rDNA擴增和測序的需要。

2.4 乳酸菌16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

圖2 乳酸菌16S rDNA片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplified products of 16S rDNA fragment

圖2為待測菌株16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖，在1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶，且無明顯拖尾現(xiàn)象，說明PCR擴增成功，能滿足后續(xù)16S rDNA序列測定的需要。

2.5 測序結(jié)果及相似性分析

登陸NCBI網(wǎng)站（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov）DNA數(shù)據(jù)庫，將各菌株的序列采用BLAST軟件與已知序列比對，同源性結(jié)果見表4。

表4 菌株的16S rDNA序列同源性比對結(jié)果Table4 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from isolates

圖3 基于16S rDNA建立的乳酸菌菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of isolated lactic acid bacteria

一般來講，在種分類等級上，如果2 個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%，則認為屬于同一個種[12]。由表4可知，16S rDNA序列同源性均大于97.5%，都鑒定到種的水平。

將上述BLAST結(jié)果的乳酸菌的序列下載下來，作為標準序列與實驗序列利用MEGA 5軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，標準序列中包括作為發(fā)育樹外群序列的雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidumDSM 20456），對所有序列進行比對后，刪除兩端未對其的堿基，生成系統(tǒng)進化樹。采用“Compute Linearized tree”的方法顯示進化樹，并通過“Image→Save as Enhanced Metafile（EMF）”功能將其轉(zhuǎn)化為圖片文件（圖3），使結(jié)果更加清晰直觀。

2.6 各泡菜樣品中的乳酸菌種類

實驗所鑒定出的乳酸菌菌株按照樣品采集地點的分布結(jié)果見表5。

表5 眉山市各區(qū)域泡菜樣品中鑒定出的乳酸菌菌種Table5 Distribution of identified lactic acid bacteria species in sampling locations

由表5可知，從12 份泡菜樣品中共鑒定出9 種乳酸菌，其中通惠的泡菜中鑒定出5 種乳酸菌，多樣性最為豐富。不同地區(qū)之間、甚至同一地區(qū)不同樣品之間乳酸菌種類都存在顯著差異，直接說明了乳酸菌的多樣性。

2.7 乳酸菌菌株按照泡菜樣品種類的分布

表6 兩種樣品中乳酸菌菌株分布情況Table6 Distribution of identified lactic acid bacteria species in different pickled vegetables

由表6可知，泡豇豆中的乳酸菌種類比泡蘿卜中的乳酸菌種類豐富，菌種構(gòu)成之間存在較大的差異，由此反映出蔬菜品種對乳酸菌多樣性有顯著影響。

已有多位學者對四川地區(qū)泡菜中的乳酸菌進行了分離鑒定，鑒定出的乳桿菌菌種主要有：植物乳桿菌（L. plantarum）、戊糖乳桿菌（L. pentosus）、短乳桿菌（L. brevis）、干酪乳桿菌（L. casei）、發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、棒狀乳桿菌（L. coryniformis）、唾液乳桿菌（L. salivarius）、食品乳桿菌（L. alimentarius）；球菌主要有：腸膜明串珠菌（L. mesenteroides）、戊糖片球菌（P. pentosaceus）[7,19-25]。文獻報道最多的菌種是植物乳桿菌和腸膜明串珠菌，所以推測它們代表了四川盆地環(huán)境中普遍存在的菌種。本研究中乳桿菌菌種構(gòu)成與現(xiàn)有的報道基本一致，樣品中也較多地檢出了植物乳桿菌，球菌中以乳酸乳球菌為主，周光燕[21]、張良[22]等也從四川泡菜中檢出了乳酸乳球菌，此外對此菌種的報道不多?？偟膩碚f，眉山泡菜樣品中檢出的乳酸菌菌種與四川地區(qū)泡菜樣品比較一致，少數(shù)的差別可能與地域、環(huán)境、基質(zhì)條件等因素有關(guān)。

3 結(jié) 論

本研究從眉山市各個地區(qū)采集了泡菜樣品12 份，其中泡豇豆7 份、泡蘿卜5 份，樣品pH值的范圍是3.37～3.89，總酸度的范圍是0.65～0.92 g/100 g（以乳酸計），鹽度的范圍是4.16%～5.28%（以NaCl計），MRS和M17培養(yǎng)基的乳酸菌計數(shù)分別是1.71～6.33、1.33～5.78 （lg（CFU/g））。總酸度與pH值之間顯著負相關(guān)，乳酸菌計數(shù)與總酸度之間極顯著負相關(guān)，總酸度對乳酸菌計數(shù)影響最大。7 份泡豇豆樣品MRS培養(yǎng)基的乳酸菌計數(shù)為105～106CFU/g，M17培養(yǎng)基的乳酸菌計數(shù)為104～105CFU/g，明顯高于5 份泡蘿卜樣品的乳酸菌計數(shù)（10～103CFU/g和10～102CFU/g），可能是由于泡蘿卜總酸度較高和蘿卜含有抗菌成分的影響。

從泡豇豆中共分離鑒定出12 株乳酸菌：Lactobacillus fermentum（D1-1、D6-1）、Lactobacillus plantarum（D2-1、D3-1、D7-1）、Lactobacillus brevis（D2-2、D5-2）、Lactobacillus acidophilus（D5-3）、Lactococcus lactis（D5-1、D6-2）、Pediococcus pentosaceus（D3-2、D4-1），從泡蘿卜中共分離鑒定出4 株乳酸菌：Lactobacillus casei（L3-1）、Lactobacillus pentosus（L3-2）、Lactobacillus delbrueckii（L4-1）、Lactococcus lactis（L4-2）。泡豇豆中的乳酸菌種類比泡蘿卜的豐富，菌種構(gòu)成之間存在較大的差異，眉象、新區(qū)、新街、通惠、眉東5 個采樣地點的樣品之間乳酸菌的種類也存在顯著差異。本研究探討了眉山泡菜乳酸菌的多樣性，也為泡菜發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)積累了生產(chǎn)用菌種。

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Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria in Pickled Vegetables from Meishan City

YANG Jixia, ZHANG Liling, JIANG Houyang, HE Zhifei*(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing Technology, Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Center, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective∶ To investigate chemical properties and lactic acid bacteria (LAB) of pickles from Meishan, Sichuan province. Methods∶ Totally 12 samples were collected from 5 locations of Meishan city. The pH, total acidity and salinity of these samples were determined. MRS and M17 agar plate were used to enumerate LAB, and all isolated strains were identified at the species level by 16S rRNA sequence analysis. Results∶ The ranges of pH, total acidity and salinity were 3.37-3.89, 0.65-0.92 g/100 g and 4.16%-5.28%, respectively. The LAB enumeration by MRS and M17 agar plate was in the range of 1.71-6.33 and 1.33-5.78 (lg(CFU/g)), respectively. Total acidity had a significant impact on LAB enumeration. Totally 16 LAB strains were isolated and identified from Meishan pickles, includingLactobacillus fermentum(2 strains),Lactobacillus plantarum(3 strains),Lactobacillus brevis(2 strains),Lactobacillus acidophilus(1 strain),Lactobacillus casei(1 strain),Lactobacillus pentosus(1 strain),Lactobacillus delbrueckii(1 strain),Lactococcus lactis(3 strains) andPediococcus pentosaceus(2 strains). Conclusion∶ This study reveals the biodiversity of lactic acid bacteria in Meishan pickles, and the isolated strains can provide starter cultures for the fermentation industry.

pickled vegetable; lactic acid bacteria; 16S rDNA sequence analysis

TS255.54

A

1002-6630（2015）15-0158-05

2014-10-20

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（XDJK2009C039；XDJK2015C135；2362014xk11）；

2013年西南大學博士啟動基金項目（SWU113035）

楊吉霞（1978—），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yangjx@188.com

*通信作者：賀稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：zfhe2003@yahoo.com.cn