陳蕓蕓，陸兆新*，盧 靜，楊 杰，魏照輝

植物乳桿菌fmb10產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化

陳蕓蕓1,2，陸兆新2,*，盧 靜2，楊 杰2，魏照輝2

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210000）

通過單因素試驗(yàn)對影響植物乳桿菌fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的8個(gè)影響因子進(jìn)行初篩，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法確定顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域，運(yùn)用Design-Expert軟件的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）對顯著影響因子的重要水平和交互作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30.38℃、葡萄糖質(zhì)量濃度21.1 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度11.0 g/L，在此條件下，植物乳桿菌fmb10發(fā)酵上清液對大腸桿菌抑菌圈直徑平均為22.90 mm，與預(yù)測值22.89 mm高度吻合，優(yōu)化后植物乳桿菌fmb10發(fā)酵上清液抑菌圈直徑較原始抑菌圈直徑（18.37 mm）提高了24.66%。

植物乳桿菌；細(xì)菌素；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面

乳酸菌細(xì)菌素已成為天然防腐劑研究與開發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)[1]。它是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物[2-3]。廣譜性乳酸菌細(xì)菌素的開發(fā)已經(jīng)成為乳酸菌研究的熱點(diǎn)之一[4]，近幾年越來越多的抑菌廣譜性細(xì)菌素被發(fā)現(xiàn)[5]。目前已在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)50余種羊毛硫細(xì)菌素[6]，一部分乳酸菌細(xì)菌素已作為天然食品添加劑用于食品保藏以減少化學(xué)防腐劑的添加量[7]。

本實(shí)驗(yàn)從福建漳州程溪本地特色水果鳳梨中篩選得到一株具有廣譜抑菌活性的植物乳桿菌fmb10，為提高其植物乳桿菌素產(chǎn)量，對其進(jìn)行了單因素初篩、Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定顯著影響因子、最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域、響應(yīng)面法的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central compositedesign，CCD）對顯著影響因子的重要水平和交互作用進(jìn)行研究，以確定植物乳桿菌fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的最佳發(fā)酵條件，提高細(xì)菌素的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1菌種

供試菌株：分離自福建漳州程溪菠蘿，編號fmb10。

指示菌：大腸桿菌（E. coli），南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2培養(yǎng)基

乳酸菌活化及篩選采用MRS培養(yǎng)基[8]；指示細(xì)菌采用NA培養(yǎng)基[9]。

1.3方法

1.3.1菌種的活化與培養(yǎng)

植物乳桿菌fmb10經(jīng)傳代活化后，以1%接種量接入液體MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h[10]。

1.3.2指示菌平板制備及抑菌活性的測定

用移液槍吸取過夜培養(yǎng)的幼齡大腸桿菌1 mL于100 mL NA培養(yǎng)基中（50℃），充分搖勻，靜置冷卻備用；采用打孔擴(kuò)散法測定抑菌活性[11]。

1.3.3單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 發(fā)酵溫度

分別設(shè)定發(fā)酵溫度為28、30、35、37、40℃，裝液量100 mL/250 mL，發(fā)酵24 h。

1.3.3.2初始pH值

用HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，30℃、裝液量100 mL/250 mL，發(fā)酵24 h。

1.3.3.3裝液量

設(shè)定裝液量為40、60、80、100、120 mL/250 mL，30℃條件下發(fā)酵24 h。

1.3.3.4碳源

分別添加20 g/L的葡萄糖（G）、蔗糖（S）、麥芽糖（M）、乳糖（L），10 g/L G+10 g/L S、10 g/L G+ 10 g/L L、10 g/L G+10 g/L M，37℃，發(fā)酵24 h。單一碳源葡萄糖（G）質(zhì)量濃度分別設(shè)為5、10、20、30 g/L，以不添加任何碳源為空白對照。

1.3.3.5氮源

分別添加20 g/L的蛋白胨（PP）、牛肉膏（BE）、酵母膏（Y E）、胰蛋白胨（T P）、檸檬酸三銨（AC），10 g/L YE+2 g/L AC（配方1）、10 g/L YE+10 g/L TP（配方2）、10 g/L YE+10 g/L TP+ 2 g/L AC（配方3）、10 g/L YE+10 g/L TP+5 g/L AC（配方4）、10 g/L YE+10 g/L BE+2 g/L AC（配方5）、10 g/L YE+10 g/L PP+2 g/L AC（配方6）、10 g/L YE+ 10 g/L TP+5 g/L PP+2 g/L AC（配方7），以不添加氮源為空白對照。

1.3.3.6磷酸鹽

分別添加2 g/L的Na3PO4、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4；替換NaH2PO4添加量為1、2、3、4 g/L，以不添加磷酸鹽為空白對照。

1.3.3.7金屬離子

培養(yǎng)基中分別添加2 g/L的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnCl2、CuSO4、FeSO4，發(fā)酵24 h，以不添加金屬離子為空白對照。

1.3.3.8生長因子

培養(yǎng)基中吐溫-80體積分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，發(fā)酵24 h。

1.3.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用數(shù)據(jù)處理軟件Minitab 16的Plackett-Burman設(shè)計(jì)法創(chuàng)建試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)，對溫度、碳源、氮源、磷酸鹽、金屬離子5個(gè)主要因素進(jìn)行考察，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析，考察各因素對fmb10產(chǎn)細(xì)菌素影響的顯著性。

1.3.5最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因子，以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素抑菌圈直徑的大小確定變化步長，逼近最佳區(qū)域，以建立有效的響應(yīng)面擬合方程。

1.3.6響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件模型的建立及其顯著性

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選出3個(gè)顯著影響的因素，運(yùn)用Design-Expert軟件的CCD法，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以-1、0、1編碼進(jìn)行試驗(yàn)后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分析各因素對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素活性的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，確定fmb10產(chǎn)細(xì)菌素的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)酵條件對植物乳桿菌fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響

圖1 不同發(fā)酵溫度（a）、初始pH值（b）和裝液量（c）對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.1 Effects of culture temperature (a), initial pH (b) and medium volume (c) on the production of plantaricin

在不同發(fā)酵溫度、初始pH值及裝液量條件下發(fā)酵，考察發(fā)酵條件對植物乳桿菌fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響，結(jié)果見圖1。30℃時(shí)菌株fmb10的抑菌圈直徑最大，這與Ogunbanwo等[12]很多研究一致，在30℃時(shí)最有利于植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素。也有報(bào)道某些植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的最佳發(fā)酵溫度較低，Delgado等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus plantarum17.2b在24℃時(shí)抑菌活性最高。初始pH值和裝液量對菌株fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素影響不明顯，本試驗(yàn)選擇初始pH 6.0、裝液量100 mL/250 mL為后續(xù)研究的發(fā)酵條件。

2.2植物乳桿菌fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.2.1主要營養(yǎng)成分

圖2 不同碳源對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the production of plantaricin

如圖2、3所示，單純加葡萄糖（G）為碳源，菌株fmb10的抑菌活性明顯高于其他碳源，且初始添加量為20 g/L時(shí)抑菌活性最大，Matsusaki等[14]研究也報(bào)道，Nisin Z類乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)生的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。

圖3 不同質(zhì)量濃度葡萄糖對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.3 Effects of glucose concentration on the production of plantaricin

圖4 20 g/L不同單一氮源（a）和復(fù)合氮源（b）對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.4 Effects of individual and combined nitrogen sources on the production of plantaricin

由圖4a、4b可知， 檸檬酸三銨（AC）為氮源時(shí)，由于使得最終發(fā)酵液體系pH值過高，抑制了菌株fmb10細(xì)菌素的產(chǎn)生；而添加20 g/L酵母膏（YE）培養(yǎng)得到的fmb10菌株抑菌活性最高；混合氮源明顯比單一氮源更有利于提高菌株fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素，其中以10 g/L YE+10 g/L PP+2 g/L AC的組合抑菌作用最強(qiáng)，說明檸檬酸三銨（AC）作為單一氮源不適合，但作為復(fù)合氮源的成分，有重要的pH值緩沖作用，這與魯淵[15]的分析結(jié)果一致。

2.2.2其他成分

磷酸鹽的種類和質(zhì)量濃度對細(xì)菌素產(chǎn)量變化有著明顯的影響[16]。圖5、6結(jié)果顯示，NaH2PO4對菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素的效果最佳，其質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)菌株fmb10的抑菌活性最大。

圖5 不同2 g/L的磷酸鹽對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.5 Effects of different phosphate sources (2 g/L) on the production of plantaricin

圖6 不同質(zhì)量濃度NaH2PO4對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.6 Effects of NaH2PO4concentration on the production of plantaricin

圖7 不同2 g/L的金屬離子對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.7 Effects of different metal ions (2 g/L) on the production of plantaricin

金屬離子不僅影響細(xì)菌的生長，如Mg2+、Mn2+和Fe2+會明顯促進(jìn)細(xì)菌生長[17]，Cu2+具有較強(qiáng)的抑制作用[18]，同時(shí)也影響細(xì)菌素的發(fā)酵生產(chǎn)，極低質(zhì)量濃度的Ca2+就能促進(jìn)Nisin的活性提高20%[14]，而Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng)[19]。由圖7可知，Cu2+對菌株fmb10合成細(xì)菌素有強(qiáng)烈的抑制作用，而2 g/L Na+可以提高菌株fmb10的抑菌活性，其他金屬離子對菌株fmb10細(xì)菌素的合成無明顯提高作用。

圖8 不同體積分?jǐn)?shù)吐溫-80對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響Fig.8 Effects of Tween-80 concentration on the production of plantaricin

適量吐溫-80會促進(jìn)細(xì)菌素產(chǎn)生并提高抑菌活性，但過量吐溫-80會和硫酸銨反應(yīng)形成沉淀，導(dǎo)致純化工藝變復(fù)雜[15]。由圖8可知，吐溫-80可提高細(xì)菌素的合成，但隨著其體積分?jǐn)?shù)增大到0.5%，抑菌作用開始降低，加之高體積分?jǐn)?shù)吐溫-80不利于分離純化，故選擇最適體積分?jǐn)?shù)為0.1%。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇5個(gè)對植物乳桿菌fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素有重要作用的因素：發(fā)酵溫度、葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母膏質(zhì)量濃度、NaH2PO4質(zhì)量濃度、NaCl質(zhì)量濃度，以抑菌圈直徑為指標(biāo)進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，考察這些因素對fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響，試驗(yàn)因素水平與結(jié)果見表1。

Plackett-Burman方差分析和各因素顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表2，對菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素具有顯著影響的因子為：X1（P=0.006）、X2（P=0.014）和X3（P=0.015），且均為正效應(yīng)，說明這3個(gè)因素在水平上限時(shí)更有利于菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素，符合單因素篩選的試驗(yàn)結(jié)果，中心點(diǎn)應(yīng)適當(dāng)上移[20]。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Plackett-Burman design with experimental and predicted values of bacteriostatic diameter

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸模型方差分析Table2 Analysis of variance of regression model from Table2 Analysis of variance of regression model from Plackett-Burman design sign

2.4最陡爬坡試驗(yàn)接近最大響應(yīng)面區(qū)域

由Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果選取X1（發(fā)酵溫度）、X2（葡萄糖質(zhì)量濃度）和X3（酵母膏質(zhì)量濃度）這3個(gè)顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，見表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Experimental design and results of steepest ascent pathTable3 Experimental design and results of steepest ascent path

由表3可知，最佳因素的條件處于第3組，故以30℃、20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母膏作為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.5響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.5.1預(yù)測模型建立及顯著性檢驗(yàn)

通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出顯著影響因子，并通過最陡爬坡試驗(yàn)確定接近響應(yīng)值區(qū)域的因素水平，采用CCD進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見表4。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table4 Central composite design with experimental values of bacteriostatic diameter

利用Design-Expert分析軟件對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值抑菌圈直徑（Y）對自變量X1、X2和X3的二次多項(xiàng)回歸方程：

對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5，該模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.000 1），回歸方程的失擬性（P=0.164 3）檢驗(yàn)不顯著?；貧w模型的R2Adj=0.982 8，說明該模型能解釋98.28%的變化，決定系數(shù)R2=0.992 5，表明菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素抑菌活性的實(shí)測值與預(yù)測值之間有很好的擬合度。因此，此模型可用于分析和預(yù)測菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸模型方差分析結(jié)果Table5 Analysis of variance of regression model from central composite design for bacteriostatic activity of plantaricin

2.5.2發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

由中心組合回歸模型得到的響應(yīng)面圖見圖9，分別體現(xiàn)了影響菌株fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的各顯著因素間兩兩交互作用?？梢钥闯?，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，通過軟件分析，穩(wěn)定點(diǎn)即最大值點(diǎn)，所對應(yīng)的各顯著因素最佳條件分別為發(fā)酵溫度30.38℃、葡萄糖質(zhì)量濃度21.1 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度11.0 g/L，此時(shí)fmb10發(fā)酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)到22.89 mm。

圖9 各因素交互作用對菌株fmb10細(xì)菌素合成影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot showing the interactions of experimental factors on the production of plantaricin

2.5.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以發(fā)酵溫度30℃、葡萄糖質(zhì)量濃度21.1 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度11.0 g/L，分3批發(fā)酵菌株fmb10并測定其發(fā)酵上清液的抑菌活性，得到抑菌圈直徑分別為23.01、22.93、22.76 mm，平均值為22.90 mm，與預(yù)測值22.89 mm非常接近，比原始發(fā)酵上清液抑菌圈直徑（18.37 mm）提高了24.66%。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對菌株fmb10產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定發(fā)酵溫度、葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母膏質(zhì)量濃度為顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域，最終運(yùn)用Design-Expert軟件的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對顯著影響因子的重要水平和交互作用進(jìn)行了研究，得到主要因子的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30.38℃、葡萄糖質(zhì)量濃度21.1 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度11.0 g/L，在此優(yōu)化條件下對菌株fmb10進(jìn)行發(fā)酵并測定發(fā)酵上清液的抑菌活性，同得到發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑平均值為22.90 mm，比原始發(fā)酵上清液抑菌圈直徑（18.37 mm）提高了24.66%，與預(yù)測值22.89 mm也非常接近，說明回歸方程較真實(shí)地反映了篩選出的顯著因子對菌株fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響，建立的模型與實(shí)際情況基本相吻合，采用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株fmb10發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素是有效可行的。

對發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮，并通過有機(jī)溶劑萃取、Sephadex LH-20分子篩及Sephadex G-25層析等純化后測定其抑菌圈大小，結(jié)果顯示其仍然具有很高的抑菌活性，此優(yōu)化后的發(fā)酵條件為后續(xù)將要進(jìn)行的細(xì)菌素分離純化鑒定工作提供了基礎(chǔ)。

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Optimization of Culture Conditions for Plantaricin Produced by Lactobacillus plantarum fmb10

CHEN Yunyun1,2, LU Zhaoxin2,*, LU Jing2, YANG Jie2, WEI Zhaohui2
(1. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou 363000, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210000, China)

Influences of 8 factors (including medium components and culture conditions) on the production of plantaricin byLactobacillus plantarumfmb10 were evaluated by Plackett-Burman design to select the most significant factors. Subsequently, the path of steepest ascent design was used to approach the optimal region, followed by the use of central composite design (CCD) and response surface methodology for further optimization of the selected significant factors. Culture temperature, glucose concentration and yeast extract concentration were found to be the factors with the most significant influence on plantaricin production, and their optimum levels were determined as 30.38℃, 21.1 g/L and 11.0 g/L, respectively. Under the optimum conditions, the bacteriostatic diameter of the fermentation supernatant was 22.90 mm, indicating a 24.66%increase compared with that (18.37 mm) obtained before optimization.

Lactobacillus plantarum; plantaricin; Plackett-Burman design; response surface methodology

Q93.331

1002-6630（2015）17-0140-06

10.7506/spkx1002-6630-201517027

2014-09-16

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B05）

陳蕓蕓（1978—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：windy970530@163.com

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn