謝旻皓，王晴川，徐冬蘭，劉天囡，孫 怡*，曾曉雄

苦丁茶冬青苦丁茶提取物與3,5-雙咖啡酰奎尼酸對(duì)腸道微生物體外發(fā)酵的影響

謝旻皓，王晴川，徐冬蘭，劉天囡，孫 怡*，曾曉雄

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

制備苦丁茶冬青苦丁茶的水提物和醇提物，并通過HP-20大孔樹脂層析和半制備色譜分離純化得到苦丁茶多酚中含量較高的3,5-雙咖啡?？崴幔?,5-dicaffeoylquinic acid，3,5-diCQA）組分。運(yùn)用體外厭氧發(fā)酵和熒光原位雜交技術(shù)，探究了苦丁茶提取物和3,5-diCQA對(duì)腸道微生物菌群的影響，并測(cè)定了發(fā)酵體系中短鏈脂肪酸和乳酸的含量。結(jié)果表明，苦丁茶冬青苦丁茶水提物、醇提物和3,5-diCQA能促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌/腸球菌的生長，同時(shí)抑制溶組織梭狀菌、普雷沃勒氏菌的生長；與空白對(duì)照相比，它們還能促進(jìn)甲酸、乙酸和丙酸的生成，但對(duì)丁酸的合成沒有影響。因此，苦丁茶冬青苦丁茶及3,5-diCQA具有一定的調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用。

苦丁茶冬青苦丁茶；多酚；3,5-雙咖啡?？崴?；腸道微生物

苦丁茶是一類中國傳統(tǒng)代茶飲料的統(tǒng)稱，在我國已有2 000多年的飲用歷史[1]。它廣泛分布于我國海南、廣西、浙江、貴州、福建、江西等省份，涉及12個(gè)科13個(gè)屬共30多種植物，主要包括木犀科苦丁茶和冬青科苦丁茶兩大類[2]。冬青科苦丁茶包含苦丁茶冬青（Ilex kudingchaC.J. Tseng）、大葉冬青（I. latifoliaThunb）以及枸骨（I. cornutaLindl）等。目前苦丁茶市場(chǎng)上主流的商品原植物為苦丁茶冬青、大葉冬青和粗壯女貞（Ligustrum robustum（Roxb.）Blume）[3]?？喽〔韪缓喾宇?、萜類、黃酮類、多糖等活性物質(zhì)，具有清熱、解毒、消腫止痛、除煩解渴、除風(fēng)祛濕、降血糖、降血脂、降血壓、抗血栓、活血脈等藥理功能[4-7]?？喽〔瓒喔缓亩喾宇愇镔|(zhì)具有抗氧化活性并且被證明是咖啡酰奎尼酸類化合物（caffeoylquinic acids，CQAs）[8]。冬青科苦丁茶中的主要多酚是CQAs，包括3-O-咖啡酰奎尼酸（3-CQA）、4-O-咖啡?？崴幔?-CQA）、5-O-咖啡?？崴幔?-CQA）、3,5-O-雙咖啡?？崴幔?,5-diCQA）和4,5-O-雙咖啡酰奎尼酸（4,5-diCQA），與木犀科苦丁茶中所含有的多酚成分完全不同[9]。

膳食中的多酚在經(jīng)過小腸時(shí)，大約只有5%～10%左右能夠被吸收，而剩余絕大部分的多酚類物質(zhì)會(huì)進(jìn)入大腸，與腸道微生物發(fā)生作用[10]。腸道微生物是人體消化系統(tǒng)的重要組成部分，其菌群組成高度復(fù)雜、多樣，它們廣泛地參與機(jī)體中食物的消化吸收、免疫調(diào)節(jié)以及抵抗病原微生物感染等生理過程，對(duì)機(jī)體正常生理功能的維持具有不可忽視的作用[11-12]。研究表明，腸道菌群的結(jié)構(gòu)與肥胖存在密切關(guān)系。腸道菌群可以通過多種方式影響宿主能量的儲(chǔ)存機(jī)制，例如，腸道菌群可以將食物中機(jī)體本身不能夠消化吸收的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）而為機(jī)體提供相應(yīng)的能量，腸道菌群的存在還可以促進(jìn)一些能量代謝有關(guān)酶的基因表達(dá)，如AMP活化蛋白激酶[13]。因此，腸道菌群在脂肪形成和堆積過程中發(fā)揮了重要作用。膳食多酚進(jìn)入大腸后，會(huì)被腸道微生物進(jìn)一步代謝，這可能是多酚發(fā)揮生物活性的方式[10]。近年來，關(guān)于腸道微生物轉(zhuǎn)化多酚的報(bào)道大量涌現(xiàn)，例如，綠原酸（5-CQA）會(huì)被代謝成咖啡酸、阿魏酸、二氫咖啡酸、二氫阿魏酸、3-（3-羥基苯基）丙酸等11種產(chǎn)物[14]。另一方面，膳食多酚也會(huì)影響腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)。本課題組之前的研究表明，烏龍茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin-3-gallate，GCG）以及甲基化EGCG（EGCG3”Me）等兒茶素類能影響菌群組成[15]。但到目前為止，本課題組對(duì)膳食多酚與腸道微生物的交互作用以及多酚進(jìn)一步對(duì)機(jī)體影響的了解還很有限。

本課題組建立了苦丁茶冬青苦丁茶CQAs的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法，并且通過大孔樹脂層析和半制備液相色譜制備了高純度的CQA單體[16]。本研究采用體外厭氧培養(yǎng)糞便中腸道微生物和熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）的方法，探究苦丁茶冬青苦丁茶提取物和含量較高的組分3,5-diCQA對(duì)體外發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)的影響，并分析相應(yīng)發(fā)酵體系中SCFAs的產(chǎn)量。以期為闡述飲用苦丁茶冬青苦丁茶如何通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的方式影響機(jī)體健康提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

苦丁茶冬青苦丁茶，購自海南椰仙生物科技有限公司。

序列5’端連接熒光基團(tuán)吲哚二羧菁（Cy3）的16S rRNA寡核苷酸單鏈探針（探針名稱、靶菌種屬及探針序列見表1） 生工生物工程（上海）股份有限公司；刃天青、氯化血紅素、L-半胱氨酸、VK、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；90%低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）量子高科（中國）生物股份有限公司；大孔樹脂HP-20日本三菱公司；厭氧混合氣體（80%N2、10%H2和10%CO2） 南京特種氣體廠；4,6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚二鹽酸（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 德國Roche公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 16S rRNA寡核苷酸單鏈探針Table1 Specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes

基礎(chǔ)培養(yǎng)基[17-18]：蛋白胨2.0 g/L、酵母膏2.0 g/L、NaCl 0.1 g/L、K2HPO40.04 g/L、KH2PO40.04 g/L、MgSO4·7H2O 0.01 g/L、CaCl2·7H2O 0.01 g/L、NaHCO32.0 g/L、氯化血紅素0.02 g/L、L-半胱氨酸0.5 g/L、膽汁酸鹽0.5 g/L、吐溫-80 2.0 mL/L、VK 10μL/L、0.25 g/L刃天青溶液4 mL/L。

1.2儀器與設(shè)備

AY-120型分析天平 日本Shimadzu公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；?KTA Purifier蛋白純化系統(tǒng) 美國通用電氣公司；LyoQuest-55真空冷凍干燥機(jī) 西班牙Telstar公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；YQX-I型厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1樣品的制備

苦丁茶冬青苦丁茶水提物的制備：稱取10 g粉碎過篩的苦丁茶冬青苦丁茶粉末，加入100 mL沸水（料液比為1∶10（m/V，下同）），并于95℃水浴中浸提30 min，浸提液經(jīng)過5 000×g離心10 min后，取出上清液，濃縮、冷凍干燥得到粗提物。

苦丁茶冬青苦丁茶醇提物的制備：稱取一定量苦丁茶冬青苦丁茶粉末，按料液比1∶10加入70%乙醇溶液，80℃熱水浴浸提30 min，浸提液經(jīng)過5 000×g離心10 min后，取出上清液，濃縮、冷凍干燥得到多酚粗提物。

3,5-diCQA的制備[16]：苦丁茶冬青苦丁茶水提物經(jīng)過HP-20大孔樹脂吸附后，先后用2個(gè)柱床體積（BV）的水和70%乙醇洗脫。乙醇洗脫組分濃縮凍干后采用?KTA Purifier系統(tǒng)做進(jìn)一步純化，純化流程使用YMC-PACK ODS-A色譜柱（10 mm×250 mm，5μm），檢測(cè)波長為280 nm，每次進(jìn)樣200μL，流速為1.5 mL/min的40%甲醇洗脫。根據(jù)紫外檢測(cè)器的實(shí)時(shí)監(jiān)控結(jié)果收集洗脫液，多次上樣后，將所需的3,5-diCQA收集起來，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮凍干。

1.3.2腸道微生物體外發(fā)酵

選取3位受試者，年齡均為25歲左右，身體狀況良好、健康，且2個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素。收集受試對(duì)象的新鮮全便，混合均勻后稱取1 g并加入9 mL經(jīng)脫氧處理的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），立即放入?yún)捬跏痔紫?，旋渦振蕩混勻配制成糞便懸液。

稱取苦丁茶冬青苦丁茶水提物、醇提物、3,5-diCQA各15 mg，提前放在厭氧培養(yǎng)箱中，并加入1.35 mL滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，渦旋振蕩至混勻后，加入150μL糞便樣液，放入37℃厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵0、12、24、36、48 h時(shí)，分別取150μL發(fā)酵液用于SCFA分析，100μL用于FISH統(tǒng)計(jì)菌數(shù)。各個(gè)處理設(shè)置3組平行，設(shè)置空白組不添加任何樣品，陽性對(duì)照組加入相同量的FOS。

1.3.3腸道菌群FISH計(jì)數(shù)

腸道菌群計(jì)數(shù)參照Vernazza[18]和Sánchez-Patán[19]等的方法并略作修改。將1.3.2節(jié)中得到的100μL發(fā)酵液放入離心管，各加入300μL過濾除菌的體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛，放入4℃冰箱固定16 h。菌體完成固定后，10 000 r/min離心10 min，除去上清液，經(jīng)PBS兩次洗滌后用600μL緩沖液懸浮。

向經(jīng)過鉻明膠預(yù)先包埋的10孔油漆示載玻片的圓孔內(nèi)滴加6μL固定后的菌體懸液，放在陰暗通風(fēng)處自然風(fēng)干，再先后經(jīng)過50%、80%和96%的乙醇脫水后自然晾干。

載玻片各孔滴加10μL探針溶液，迅速放入含有雜交緩沖液（含5%NaCl、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2）的不透光濕盒中。雜交10 h以上，雜交溫度分別為：50℃（Bif164、Chis150）、45℃（Lab158、Bac303）和37℃（Erec482）。雜交結(jié)束后，用清洗緩沖液（含5%NaCl的20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2）清洗2次，再用超純水清洗，除去未雜交上的探針、緩沖液和SDS，最后避光晾干。測(cè)定總菌時(shí)，滴加10μL1.25 ng/μLDAPI染液于雜交后的載玻片上，染色10 min，用超純水清洗，避光晾干。

觀察計(jì)數(shù)前，在載玻片上滴加護(hù)色液，蓋上蓋玻片。使用Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡觀察，并使用AxioVision熒光成像系統(tǒng)隨機(jī)選取5～9個(gè)視野拍照。采用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，記錄每個(gè)視野中的熒光點(diǎn)數(shù)，即該探針特異性雜交的細(xì)菌，從而進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)。通過視野范圍內(nèi)的映光點(diǎn)數(shù)以及稀釋倍數(shù)，算出不同樣品處理和對(duì)照組發(fā)酵液中不同種屬微生物的數(shù)量。

1.3.4 SCFAs和乳酸的測(cè)定

腸道微生物體外發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs和乳酸采用HPLC測(cè)定。色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A相為超純水，B相為100%甲醇，洗脫梯度：0～10 min，10%～30%B，10～15 min，30%B；檢測(cè)波長為210 nm；柱溫為30℃；流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量20μL。分別配制濃度梯度在20～100 mmol/L范圍內(nèi)的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以其濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1苦丁茶提取物純度

一定量的苦丁茶茶粉經(jīng)熱水浸提，濃縮和凍干，得到苦丁茶水提物。由于水提物中含有一定量茶多糖、生物堿、脂類、蛋白質(zhì)類等雜質(zhì)，所以另用70%乙醇溶液浸提苦丁茶茶粉，降低雜質(zhì)的含量，同時(shí)保持苦丁茶中CQA類物質(zhì)的含量不受影響。用Folin-酚法測(cè)定苦丁茶粉末浸提得到的水提物，多酚含量達(dá)到10.33%；醇提物中，多酚含量達(dá)到18.11%。經(jīng)過大孔樹脂、半制備色譜分離純化之后，得到的3,5-diCQA產(chǎn)量較高；經(jīng)HPLC分析，純度在95%以上。

2.2苦丁茶提取物和3,5-diCQA對(duì)腸道菌群和總菌的影響

厭氧糞樣混合培養(yǎng)法在研究食源性物質(zhì)對(duì)腸道菌群的影響時(shí)被廣泛運(yùn)用，主要是該方法取自健康人體的糞便中包含了所有的人體腸道菌群，同時(shí)體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)評(píng)價(jià)系統(tǒng)具備發(fā)酵時(shí)間短、用量少、操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。此外，本實(shí)驗(yàn)采用FISH技術(shù)對(duì)菌體數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。帶有熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針，能靶向結(jié)合已經(jīng)固定的菌體細(xì)胞DNA，當(dāng)這種特異性的雜交完成后，特定的菌體帶有了熒光，通過熒光顯微鏡捕捉熒光信號(hào)，從而對(duì)菌體進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。由于人體糞便中包含所有腸道菌群，在體外模擬腸道厭氧發(fā)酵，可以初步探究樣品對(duì)腸道菌群的作用。圖1為空白對(duì)照和苦丁茶醇提物發(fā)酵12 h后，使用不同探針對(duì)發(fā)酵樣液進(jìn)行FISH處理或DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。

圖1 不同探針雜交以及DAPI染色后熒光顯微鏡下對(duì)照組和苦丁茶醇提物體外發(fā)酵后各菌群的照片（1 000×） 00Fig.1 Images of microbial communities cultured in vitro in the presence of Kudingcha ethanol extract after FISH or DAPI dying under fluorescent microscope (1 000×)

由圖1可知，苦丁茶冬青苦丁茶提取物對(duì)不同腸道微生物菌群體外發(fā)酵有顯著影響?？傮w來說，苦丁茶冬青苦丁茶提取物和3,5-diCQA能促進(jìn)不同發(fā)酵時(shí)間下雙歧桿菌（Bifidobacteriumspp.）、乳酸菌/腸球菌（Lactobacillus/Enterococcusspp.）的生長，而抑制了溶組織梭狀菌（Clostridium histolyticum）、普雷沃勒氏菌（Bacteroides-Prevotellaspp.）的生長，對(duì)雙歧桿菌的生長效果尤其明顯，對(duì)總菌的數(shù)目沒有顯著影響（P＞0.05）?？喽〔璨煌崛∥飿悠吩诓煌l(fā)酵時(shí)間對(duì)雙歧桿菌的增殖效果如表2所示。與空白對(duì)照組相比，12、36、48 h時(shí)，苦丁茶水提物、醇提物、3,5-diCQA及陽性對(duì)照組均對(duì)雙歧桿菌起到促進(jìn)增殖的顯著效果（P＜0.05）。與12 h相比，36 h時(shí)苦丁茶水提物樣品開始對(duì)雙歧桿菌有顯著的促進(jìn)增殖作用（P＜0.05），而醇提物和3,5-diCQA在24 h時(shí)對(duì)雙歧桿菌的增殖有顯著促進(jìn)效果（P＜0.05），其后，醇提物組的雙歧桿菌仍有增殖趨勢(shì)，而3,5-diCQA組的雙歧桿菌則在36 h開始有下降趨勢(shì)。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間后雙歧桿菌生長情況Table2 Numbers of Bififi dobacterium in anaerobic fermentation broth

雙歧桿菌和乳酸菌/腸球菌屬是益生菌，具有增強(qiáng)免疫、阻止有害菌黏附以及幫助宿主消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)等多種生理功能[20-21]。雖然擬桿菌門微生物廣泛參與了多糖、膽汁酸和類固醇物質(zhì)的代謝，對(duì)維持腸道功能有重要作用，但其中的普雷沃勒氏菌屬數(shù)量異常增高與潰瘍性結(jié)腸炎和肥胖密切相關(guān)[22-23]；溶組織梭狀菌和球形菌是腸道中參與代謝的重要菌群，但它們數(shù)量過多也會(huì)增加腸道潰瘍和結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[24-27]。普雷沃勒氏菌和溶鏈梭菌數(shù)量增多還會(huì)破壞人體腸道菌群的平衡，引起感染、腹瀉、痢疾等疾病[28-29]。苦丁茶冬青苦丁茶提取物以及3,5-diCQA能夠促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌/腸球菌等益生菌的增殖，抑制溶組織梭狀菌、普雷沃勒氏菌的增殖，表明苦丁茶冬青苦丁茶具有一定的調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和益生的功效。據(jù)報(bào)道，各種膳食多酚具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)的作用，如姜黃素可以降低糖尿病大鼠腸道中Melainabacteria的豐度，還可以減小厚壁菌/擬桿菌比例[30]；烏龍茶多酚可以促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌/腸球菌并且抑制溶組織梭狀菌、擬桿菌-普雷沃勒氏菌的生長[15]，表現(xiàn)出和苦丁茶冬青苦丁茶類似的作用趨勢(shì)。食品來源的成分有些可以被特定的菌群分解利用，促進(jìn)該菌群的生長；有些多酚成分對(duì)特定菌群表現(xiàn)出毒性，從而導(dǎo)致其他耐受菌群豐度的提高[31]。這可能是苦丁茶冬青苦丁茶表現(xiàn)出腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。

2.3苦丁茶提取物及3,5-diCQA對(duì)腸道微生物體外發(fā)酵SCFAs和乳酸產(chǎn)量的影響

添加了不同苦丁茶提取物的發(fā)酵體系中，各種SCFAs和乳酸的含量如表3所示。結(jié)果表明，除空白對(duì)照外，水提物、醇提物和3,5-diCQA在發(fā)酵至48 h后，甲酸產(chǎn)量最高，但與空白對(duì)照組相比，苦丁茶提取物以及3,5-diCQA對(duì)腸道微生物體外發(fā)酵的甲酸產(chǎn)量沒有顯著影響。加入苦丁茶冬青苦丁茶水提物培養(yǎng)48 h后，乙酸含量達(dá)到最高；苦丁茶醇提物組在發(fā)酵至36 h時(shí)乙酸含量達(dá)到最高，在發(fā)酵至48 h時(shí)，含量顯著下降；基礎(chǔ)培養(yǎng)基中僅添加3,5-diCQA，在0～36 h的發(fā)酵過程中，乙酸含量變化不顯著，發(fā)酵至48 h時(shí)，乙酸產(chǎn)量上升?？喽〔瓒嗫喽〔杷嵛锖?,5-diCQA經(jīng)過48 h發(fā)酵后，丙酸和乳酸含量達(dá)到最高且顯著高于空白對(duì)照，而醇提物在36 h發(fā)酵后，丙酸產(chǎn)量就達(dá)到最高。但是，腸道微生物體外發(fā)酵模型中，與腸道營養(yǎng)密切聯(lián)系的丁酸在添加了苦丁茶的體系中含量很低或沒有被檢測(cè)到。

表3 各種苦丁茶提取物對(duì)SCFAs和乳酸產(chǎn)量的影響Table3 Effects of Kudingcha extracts and 3,5-diCQA on production of SCFAs and lactic acid

SCFAs對(duì)腸道具有維持水電解質(zhì)平衡、抗病原微生物和抗炎、調(diào)節(jié)菌群平衡及改善腸道功能、抗腫瘤和調(diào)控基因表達(dá)等重要作用[32]。膳食中的碳水化合物，尤其是抗性淀粉和膳食纖維，是腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs的主要底物[33]。另外，SCFAs也是蛋白質(zhì)降解和氨基酸發(fā)酵的產(chǎn)物。梭菌可利用多種氨基酸生成相應(yīng)的有機(jī)酸[34]。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，碳水化合物較少，而很多微生物生長在多酚的作用下被抑制，以致SCFAs尤其是丁酸的產(chǎn)生量有限。

其他文獻(xiàn)也報(bào)道，多酚可能引起腸道內(nèi)微生物數(shù)量和種類的變化，改變微生物代謝及產(chǎn)酶的種類和數(shù)量；多酚代謝產(chǎn)物可與細(xì)菌細(xì)胞表面作用，抑制酶的活性，從而影響能量代謝[35]。綜合以上結(jié)果，可以初步判斷，苦丁茶冬青苦丁茶提取物及多酚可以改變腸道菌群結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)微生物代謝，具有一定的益生效果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以苦丁茶冬青苦丁茶水提物、醇提物及3,5-diCQA單體為實(shí)驗(yàn)樣品，通過體外模擬人體腸道厭氧環(huán)境，對(duì)糞樣中微生物群進(jìn)行混合培養(yǎng)，使用FISH技術(shù)對(duì)菌群結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究比較，并使用HPLC對(duì)培養(yǎng)過程中SCFAs的含量進(jìn)行監(jiān)控。結(jié)果顯示，添加了苦丁茶冬青苦丁茶提取物和3,5-diCQA的培養(yǎng)基中，雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量在36 h內(nèi)得到了一定的增長，溶組織梭狀菌、普雷沃勒氏菌等的生長被抑制。與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的甲酸、乳酸、乙酸和丙酸含量都在0～36 h內(nèi)呈升高趨勢(shì)，但丁酸產(chǎn)量很少。本研究結(jié)果表明，苦丁茶冬青苦丁茶對(duì)改善人體腸道微生態(tài)、調(diào)節(jié)腸道平衡具有一定的作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Comparative Study of the Effects on Colonic Microbiota Fermentation in vitro of Extracts from Ilex kudingcha C.J. Tseng and 3,5-Dicaffeoylquinic Acid

XIE Minhao, WANG Qingchuan, XU Donglan, LIU Tiannan, SUN Yi*, ZENG Xiaoxiong
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

We prepared aqueous and ethanolic Kudingcha extracts fromIlex kudingchaC.J. Tseng and3,5-dicaffeoylquinic acid,the main fraction of Kudingcha polyphenols, purified from the aqueous extract by HP-20 macroporous resin chromatography and semi-preparative chromatography. Anaerobic fermentation technology and fluorescencein situhybridization were employed to investigate the effects of the Kudingcha extracts and 3,5-diCQA on fermentation characteristicsin vitroof the human gut mictobiota, and the production of short-chain fatty acids and latic acid during the culture we re also examined. The results showed that both Kudingcha extracts and 3,5-diCQA could promote the growthofBifi dobacteriumspp. andLactobacillus/Enterococcusspp., and inhibitBacteroides-Prevotellaspp. andClostridiumhistolyticumgroup. The concentrations of formic, acetic and proponic acids in cultures with Kudingch extracts were relatively higher than those of the control, but there was no difference in butyric acid. The results suggest that both Kudingcha fromI. kudingchaC.J. Tseng and its polyphenol 3,5-diCQA have potential prebiotic-like activity by modulating the intestinal microbiota.

Kudingcha; polyphenol; 3,5-dicaffeoylquinic acid (3,5-diCQA); colonic microbiota

TS272；TS201.3

1002-6630（2015）17-0124-06

10.7506/spkx1002-6630-201517024

2014-12-22

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171666）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

謝旻皓（1990—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2014208020@njau.edu.cn

*通信作者：孫怡（1966—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn