陳麗華，曹可生，彭勤龍，潘自紅，馬慶一

（平頂山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 平頂山 467000）

五種中草藥水溶性多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

陳麗華，曹可生，彭勤龍，潘自紅，馬慶一

（平頂山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 平頂山 467000）

從山茱萸、知母、甘草、地榆及訶子中提取水溶性多糖，并通過(guò)酶抑制動(dòng)力學(xué)反應(yīng)考察其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響。酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)結(jié)果表明：地榆多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶有激活作用；知母多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性隨時(shí)間的變化先激活后抑制；山茱萸多糖、甘草多糖及訶子多糖均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制活性，其中抑制活性最好的是甘草多糖，其抑制率為72.5%；其各自的影響機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

山茱萸；知母；甘草；地榆；訶子；α-葡萄糖苷酶；抑制率

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，已經(jīng)成為繼心血管和腫瘤之后的第三位“健康殺手”[1]。 研究還表明，餐后高血糖對(duì)心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的影響[2]，α-葡萄糖苷酶又是血糖產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性而降低餐后血糖是糖尿病防治的根本辦法之一[3]，為此以降低α-葡萄糖苷酶活性為目的的糖尿病新藥α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究逐漸興起[4-11]。

從近些年來(lái)看，α-葡萄糖苷酶抑制劑大多從中草藥植物中提取，提取的有效成分包括多糖，皂甙、黃酮、單寧、有機(jī)酸和生物堿等幾大類[12]，其中尤以水溶性多糖提取f分離、純化時(shí)試劑相對(duì)安全和其本身沒(méi)有細(xì)胞毒性最為關(guān)注，據(jù)報(bào)道，已有近百種植物多糖被分離提取并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，用于探討其降糖效果和機(jī)理研究[13，14]。

1 儀器試劑和材料

FFC-15粉碎機(jī):山東即墨農(nóng)業(yè)機(jī)械廠；QYQ微量移液器 ：北京表云航空儀表有限公司；ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海醫(yī)械專機(jī)廠；TGL-18C高速臺(tái)式離心機(jī): 上海安亭科學(xué)儀器廠； ZF-C三用紫外燈:上?？岛坦怆妰x器有限公司；80-1離心沉淀器：上海手術(shù)器械廠；紫756MC外可見(jiàn)分光光度計(jì) ：上海分析儀器廠；85-2磁力攪拌器江蘇中大儀器廠；

對(duì)硝基苯酚（PNP）儀征市鼎信化工有限公司；α－葡萄糖苷酶 SIGMA；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) E.Merck公司；拜糖平：購(gòu)于鄭州藥店；APD-600大孔樹(shù)脂 西安樹(shù)脂廠；山茱萸、地榆、知母、甘草、訶子均購(gòu)于鄭州中藥城；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中草藥中多糖成分的提取[15]

取一定量的山茱萸、地榆、知母、甘草、訶子粉碎過(guò)40目篩，備用。取5個(gè)潔凈的500 mL的圓底燒瓶，稱取山茱萸、地榆、知母、甘草、訶子等五種中草藥粗粉50 g分別加入其中,再分別加入95%乙醇（原料與醇的比為1∶10 w/v），加熱回流2 h,熱抽濾,取所得濾渣再用95%乙醇（原料與醇比為1∶8 w/v），再回流2 h, 后熱抽濾，取濾渣加蒸餾水（原料與水比為1 ∶8 w/v）在55 ℃水浴下攪拌提取2 h,趁熱抽濾，收集濾液，濾渣再加蒸餾水（原料與水比為1 ∶6 w/v）再回流提取2 h,趁熱減壓抽濾，收集并合并前次濾液，減壓濃縮至原體積1/3，后加入適量的聚酰胺樹(shù)脂過(guò)夜，后減壓抽濾，收集濾液并真空濃縮后，定容，冷藏，待進(jìn)行其組分的定性檢測(cè)及酶抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

2.2 多糖的定性檢測(cè)[16,17]

α-萘酚試驗(yàn)（Molisch紫環(huán)反應(yīng)）：取待檢樣品水溶液1 mL于試管中，先加入萘酚試劑（5%）3-5滴后充分振搖（注意不要濺出），再沿管壁滴入5-6滴濃硫酸，溶液出現(xiàn)分層，靜置，待2～3 min后，觀察兩層液面間變化（出現(xiàn)紫紅色環(huán)示有多糖或糖苷）。

三氯化鐵試驗(yàn)：取待檢樣品的水溶液1 mL于試管中，加入FeCl3試劑2滴，觀察顏色(呈現(xiàn)綠色、污綠色、藍(lán)黑色或暗紫色示有鞣質(zhì)類物質(zhì))。

明膠試驗(yàn)：取待檢檢樣品的水溶液1 mL于試管中，加NaCl-明膠試劑2～3滴，觀察結(jié)果（生成白色沉淀物示有鞣質(zhì)類物質(zhì)）。

鹽酸-鎂粉試驗(yàn)：取待檢樣品少許溶于乙醇中，取該溶液1mL于試管中，先放少量鎂粉，然后滴加濃鹽酸4～5滴，后置沸水浴中加熱2～3 min，觀察顏色（出現(xiàn)紅色或粉紅色有游離黃酮類或黃酮甙）。

泡沫試驗(yàn)：取待檢樣品的水溶液2 mL加入帶塞試管中，用力持續(xù)振搖3 min，觀察泡沫情況（產(chǎn)生持久性蜂窩狀泡沫，泡沫可維持10 min以上且泡沫量應(yīng)超過(guò)液體體積的1/3為皂苷）。

醋酐濃硫酸試驗(yàn)（Liebrmann Burchard反應(yīng)）:取待檢樣品的水溶液少許，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，先加入少量冰醋酸于殘?jiān)惺蛊淙芙?，再加入醋?濃硫酸（19∶1）試劑，觀察顏色變化（由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色、紫色、藍(lán)色或綠色為皂苷類）。

氯仿-濃硫酸實(shí)驗(yàn)(Tschugaeff反應(yīng)): 取待檢檢品的水溶液少許置蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸干，先加入少量氯仿于殘?jiān)?收集溶液于試管中，后再加入濃硫酸少許于試管,觀察氯仿層顏色（呈現(xiàn)紅或藍(lán)色,硫酸層有綠色熒光出現(xiàn)）。

溴甲酚綠實(shí)驗(yàn)：在干燥的濾紙上滴1滴待檢液體，待干燥后噴灑溴甲酚綠指示劑，觀察顏色（有機(jī)酸即可在藍(lán)色的背景上顯黃色）。

2.3 多糖成分抑制效果的測(cè)定

2.3.1 α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定

方法1：取六支帶塞試管，分別加入3 mL緩沖液（pH 6.81）和0.75 mL的PNPG溶液(2 mmol/L),于37℃水浴中保溫10 min后，隨后再分別加入15 μL的α -葡萄糖苷酶（酶的濃度為5.0 mg/mL）, 再于37℃水浴中反應(yīng)，在2，4，6，8，10，15 min時(shí)各取一支加入適量4% Na2CO3用以終止上述反應(yīng)，在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光值【18】。同時(shí)用未加酶的反應(yīng)液為空白對(duì)照，以消除PNPG自身水解后產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚（PNP）對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)下吸光度的影響所造成偏差。

方法2：取一比皿，直接加入3 mL緩沖液（pH6.81）和0.75 mL的PNPG溶液(2 mmol/L)，放置10 min后再加入15 μL的α-葡萄糖苷酶（酶的濃度為5.0 mg/mL），每一分鐘記錄一次吸光度值。同時(shí)也用未加酶的反應(yīng)液為空白對(duì)照。

2.3.2 各多糖的酶反應(yīng)抑制活性的測(cè)定

反應(yīng)體系見(jiàn)表1，操作同2.3.1中的方法2，以反應(yīng)15 min時(shí)的吸光值為基準(zhǔn)計(jì)算各組分的抑制率，實(shí)驗(yàn)以拜糖平標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。抑制率計(jì)算：

表1 各提取液抑制活性的反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for evaluating the effects of extracts on the activity of a-glucosidase

表2 定性檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of qualitative test for inhibitors

3 結(jié)果與討論

3.1 提取率

從山茱萸、地榆、知母、甘草、訶子中提取、分離并部分純化得到多糖得率分別為2.00%、1.27%、5.2%、3.0%、1.3%。

3.2 多糖成分的定性檢測(cè)

山茱萸、地榆、知母、甘草、訶子所提取多糖的定性檢測(cè)結(jié)果如表2所示 。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的確定和α－葡萄糖苷酶活性的測(cè)定

由實(shí)驗(yàn)記錄的37 ℃和室溫26 ℃下所測(cè)時(shí)間所測(cè)得的的吸光度數(shù)值，繪制成A～t曲線，如圖1所示。

圖1 兩種溫度下A～t曲線圖Fig.1 The absorb value curves of different temperature with time

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)所取的這兩個(gè)溫度下吸光度僅有的差別是絕對(duì)數(shù)值的不同，但兩曲線的變化趨勢(shì)基本相像（即在同樣的時(shí)間點(diǎn)上完成從直線到上翹弧線至平臺(tái)的過(guò)渡），鑒于本實(shí)驗(yàn)考察的是多糖抑制率，與絕對(duì)值關(guān)系不大，為此實(shí)驗(yàn)擬將傳統(tǒng)Tremblay[19]測(cè)定法改為在室溫下比色皿中直接測(cè)定，方便實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

3.4 多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的作用效果及其與拜堂平的比較

圖2 多糖對(duì)酶作用的時(shí)間與吸光度曲線圖（拜糖平為對(duì)照）Fig.2 The absorb value curves of all inhibitors extracted from Chinese herbals with time

山茱萸、地榆、知母、甘草、訶子中提取的活性多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響結(jié)果如圖2所示，各組分對(duì)酶的抑制效果及與拜堂平的比較見(jiàn)圖2。由圖顯示結(jié)果可知：山茱萸多糖、訶子多糖和甘草多糖均對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，其中，甘草多糖的抑制性最好；地榆多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有激活作用；知母多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響隨時(shí)間的改變而不同，在0～11 min內(nèi)是激活，11～15 min內(nèi)是抑制，但抑制效果不顯著。

以第15 min的吸光度計(jì)算有抑制活性多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率，可得訶子多糖抑制率為1.6%，山茱萸多糖抑制率為16.9%，抑制效果最好的是甘草多糖，抑制率為72.5%，且高于同濃度對(duì)照品拜糖平(糖平的抑制率為68.5%)。抑制率結(jié)果的直方圖如圖3所示。

圖3 各成份的α-葡萄糖苷酶抑制率圖Fig.3 The inhibit ratio of all inhibitors extracted from Chinese herbals

4 結(jié)論與展望

山茱萸、知母、甘草、地榆及訶子中提取水溶性多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響各不一樣，知母多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性隨時(shí)間的變化先激活后抑制，在0～11 min內(nèi)對(duì)糖苷酶起激活作用，11～15 min內(nèi)是抑制作用，但抑制效果不顯著；山茱萸、甘草和訶子這三種中草藥提取得到的水溶性多糖均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，其中抑制活性最好的是甘草多糖，其抑制率為72.5%，訶子多糖抑制效果極差，僅為1.6%；其各自的影響機(jī)理及其它條件都還有待進(jìn)一步研究。

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Influence on the Activity of α-glucosidase by Water-soluble Polysaccharide Form Five Kinds of Chinese Herbal

CENG Li-hua，CAO Ke-sheng，PEGN Qin-long，PAN Zi-hong，MA Qing-yi
（School of Chemistry and Chemical Engineering,Pingdingshan University, Pingdingshan Henan 476000，China )

The water-soluble polysaccharide was extracted from Cornus officinalis,Rhizoma anemarrhenaes, Licorice, Sanguisorba officinalis and Terminalia chebula ribs. Influence of these water-soluble polysaccharides on the activity of α-glucosidase was investigated by enzyme kinetics reaction. The results show that sanguisorba officinalis polysaccharide has the activation function to α-glucosidase;influence of Rhizoma anemarrhenae polysaccharide on α-glucosidase activity changes with time, activation first and then inhibition; Cornel polysaccharide, Licorice polysaccharide and Terminalia chebula ribs polysaccharide have inhibitory activities against α-glucosidase. Licorice polysaccharide shows the best α-glucosidase inhibitory activity of all, the inhibition rate can reach to 72.5 %.

Cornus officinalis; Rhizoma anemarrhenaes; Licorice; Sanguisorba officinalis ; Terminalia chebula ribs; α-glucosidase; Inhibition rate

TQ 028

： A

： 1671-0460（2015）01-0021-03

2014-07-07

陳麗華（1977-），女，河南信陽(yáng)人，副教授，碩士研究生，2006年畢業(yè)于鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程專業(yè)，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)與食品功能因子。E-mail：249549769qq.com