戴強生 陳志勇 張鉑 龍健婷 李鶴平

臨床研究論著

染色體核型和單核苷酸多態(tài)性檢測對AML預后評估的臨床分析

戴強生 陳志勇 張鉑 龍健婷 李鶴平

目的探討不同染色體核型及單核苷酸多態(tài)性（SNP）的急性髓系白血?。ˋML）患者、尤其是具有正常染色體核型患者預后的異同。方法應用G-顯帶技術和基于SNP的高分辨基因芯片（SNPa）對23例AML患者的骨髓進行檢測，明確其染色體核型及SNP狀況；觀察患者的疾病轉(zhuǎn)歸，并分析患者疾病轉(zhuǎn)歸與其染色體信息變化的關系。結(jié)果在23例AML患者中，G-顯帶技術檢測出11例伴有異常染色體核型，12例為正常染色體核型。SNPa檢測出19例患者伴有基因信息異常，其中12例具有正常染色體核型的患者中有11例伴有SNP；這11例患者中有4例基因信息異常，表現(xiàn)為基因雜合性缺失（LOH）。12例具有正常染色體核型的AML患者中，有7例初次誘導即達完全緩解，經(jīng)后續(xù)治療存活至今；另有2例經(jīng)再次誘導化學治療后達完全緩解；還有3例初次誘導未達完全緩解，再次誘導化學治療后因出現(xiàn)嚴重感染或內(nèi)臟出血而死亡。11例具有異常染色體核型的AML患者中，有8例在初次誘導化學治療后達完全緩解。經(jīng)SNPa檢測發(fā)現(xiàn)，23例AML患者中，5例具有LOH的患者有4例初次誘導不緩解可能與其合并有17或21號染色體長臂特定位點發(fā)生SNP有關。結(jié)論SNPa可作為染色體核型分析的補充手段，對AML患者，特別是具有正常染色體核型患者可提供更為準確的預后評估。

急性髓系白血病；單核苷酸多態(tài)性；染色體核型分型；基因雜合性缺失

急性髓系白血?。ˋML）是一類高度異質(zhì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤。異常的染色體核型對AML的診斷、分型、預后評估、治療方案選擇、療效監(jiān)測以及了解其生物學行為具有重要作用［1］。然而，大約50%的AML患者具有正常染色體核型，運用染色體核型分析預測AML預后無法應用于這一類患者［2］。因此，急需探尋另一種可發(fā)現(xiàn)這群患者間異同、并對其預后能做出評估的方法。單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為第三代遺傳診斷標記在疾病基因組學中具有重大意義。與傳統(tǒng)技術相比，SNP芯片技術具有更高的分辨率，并且能夠檢測基因拷貝數(shù)不變的基因雜合性缺失（LOH）［3］。本文擬同時采用染色體核型分析技術及基于SNP的高分辨基因芯片（SNPa）檢測23例AML患者的染色體信息變化，并探討其疾病轉(zhuǎn)歸與染色體信息變化的關系。

對象與方法

一、研究對象

征得患者知情同意后，收集本課題各合作單位自2012年7月至2014年10月初治AML患者骨髓標本23例，同一患者骨髓標本分別用G顯帶技術和SNPa分析，同時用生理鹽水預濕的棉簽刮取其口腔黏膜細胞作為正常對照。參照張之南等主編的《血液病診斷及療效標準》進行AML的亞型（M0-M7）分析，并結(jié)合多流式細胞術免疫分型、細胞遺傳學特征及分子生物學特征進行綜合判斷［4］。

二、實驗方法

1.G顯帶技術

將抽取的2 ml髂后上棘骨髓按MNC2×106／ml接種于肝素抗凝的1640培養(yǎng)基中，采用24 h短期培養(yǎng)法，培養(yǎng)終止前約3 h加入秋水仙素（終濃度為0.05 μg／ml），經(jīng)低滲、固定后收獲細胞，采用G顯帶法分析細胞核型，每個樣本分析15～20個中期細胞。根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制》進行描述，至少2個細胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)重排，或3個細胞有同樣的染色體丟失，方可確認為1個異常克隆。

2.SNPa檢測

采用CytoScan 750K芯片（Affymetrix，USA）進行全基因組掃描，基本步驟如下：收集患者骨髓標本，采用QIAampDNAMiniKit（QIAGEN，USA）提取基因組DNA，經(jīng)Nsp酶消化后以T4 DNA連接酶加入Nsp I接頭后進行PCR擴增（TitaniumTaq DNA Polymerase，Clontech，USA），PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、片段化、標記、雜交和洗染后于GeneChip Scanner 3000Dx進行掃描，結(jié)果于ChAs 2.0進行分析，染色體拷貝數(shù)變異描述依據(jù)ISCN 2013。

3.化學治療方案

1例AML患者誘導化學治療采用地西他濱＋CAG方案：地西他濱20 mg／m2，每日1次，d1-5；阿克拉霉素10 mg，每日1次，d3-6；阿糖胞苷10 mg／m2，每12 h 1次，d3-9；粒細胞集落刺激因子（G-CSF）300 μg，d1-9。1例AML患者誘導化學治療采用DA方案：柔紅霉素50 mg／m2，每日1次，d1-3；阿糖胞苷100 mg，每日2次，d1-7。其余患者均采用IA或MA方案方案誘導化學治療。IA方案：伊達比星8～12 mg／m2，每日1次，d1-3；阿糖胞苷100 mg，每日2次，d1-7。MA方案：米托蒽醌8～12 mg／m2，每日1次，d1-3；阿糖胞苷100 mg，每日2次，d1-7。再次誘導化學治療選用地西他濱＋CAG方案、MAE方案或FLAG方案。鞏固化學治療方案采用MA、IA或中大劑量阿糖胞苷，中大劑量阿糖胞苷：2～3 g／m2，每12 h 1次，d1、d3、d5。隨訪6個月以上患者均已接受自體或異基因造血干細胞移植。

4.隨 訪

隨訪資料來源于住院、預約住院及門診病歷，自患者確診之日起進行隨訪。依病歷記錄或?qū)颊呒覍匐娫捖?lián)系加以確認；存活病例隨訪至2015年7月15日。

結(jié) 果

一、AML患者的一般情況

AML患者23例，其中M01例，M11例，M26例，M46例，M58例，M61例；男15例，女8例；中位年齡38歲；初診時伴有高白細胞的患者3例；隨訪時間最長的AML患者為35個月，最短為1.5個月；其中病例3、4、12、13、15分別在確診后3、1.5、1.5、3、4個月后因各種并發(fā)癥而死亡，表1中所列隨訪時間除以上5例死亡病例外，均為其確診后至今的時間。詳見表1。

二、染色體核型情況

23例AML患者中染色體核型分析檢測出11例伴有異常染色體核型（47.8%），其中病例3為復雜染色體核型；12例具有正常染色體核型（52.2%），見表2、3。

表1 23例AML患者的一般情況

表2 具有正常染色體核型AML患者的SNPa檢測結(jié)果及其疾病轉(zhuǎn)歸

續(xù)表

表3 具有異常染色體核型AML患者SNPa檢測結(jié)果及其疾病轉(zhuǎn)歸

三、SNPa檢測AML患者基因信息改變情況

23例患者中SNPa檢測出19例患者伴有基因信息異常（82.6%），其中12例具有正常染色體核型的AML患者中有11例伴有SNP；這11例患者中有4例基因信息異常表現(xiàn)為LOH，見表2。

四、染色體核型和SNP異常與AML患者疾病轉(zhuǎn)歸的關系

在23例AML患者中，15例患者在初次誘導后即達到完全緩解，其中17例患者目前仍處無病生存狀態(tài)，其中隨訪至今的最長時間為35個月。11例合并異常染色體核型的AML患者有8例在初次誘導化學治療后均達完全緩解，但病例3、9在后續(xù)隨訪中分別出現(xiàn)髓外和髓內(nèi)復發(fā)；病例3因肺部感染而死亡，病例9在最近1次隨訪時出現(xiàn)疾病復發(fā)，后續(xù)疾病轉(zhuǎn)歸需進一步觀察；病例13、16、23初次誘導化學治療未達完全緩解，經(jīng)再次誘導病例16、23達完全緩解，隨訪至今，仍無病生存；病例13經(jīng)再次誘導化學治療后疾病仍未緩解，后因髓內(nèi)復發(fā)放棄治療死亡。12例具有正常染色體核型的AML患者中，病例4、11、12、15、17經(jīng)初次誘導化學治療未完全緩解，且病例4、12、15因出現(xiàn)并發(fā)癥而死亡，病例11、17后續(xù)疾病轉(zhuǎn)歸需進一步觀察。經(jīng)SNPa檢測發(fā)現(xiàn)，23例患者中，具有LOH的5例患者有4例經(jīng)初次誘導不緩解，仔細對比發(fā)現(xiàn)可能與其合并有17或21號染色體長臂特定位點發(fā)生SNP有關；且合并17號染色體長臂特定基因位點出現(xiàn)SNP的病例4、12、15患者均預后不良。SNPa檢測發(fā)現(xiàn)伴有5號、7號染色體異?；蛐畔⒌牟±?、13患者預后不良，這與傳統(tǒng)染色體核型分析發(fā)現(xiàn)del5q、5q-、del7q、7q-預后相同。

討 論

急性白血病的預后與白血病細胞的免疫表型密切相關，但通過染色體核型分析細胞遺傳學異常仍然是AML預后評估的最重要指標［5］。在非M3組AML中，參照染色體核型異常情況，美國國家癌癥綜合網(wǎng)（NCCN）按疾病預后風險不同分為3組：①良好組，包括t（8；21）、inv（16）和t （16；16）；②中等組，包括正常核型、單純＋8、t （9；11）及其它預后良好和預后差組未提及的異常；③預后差組，包括復雜異常（＞3個異常）、-5、-7、5q-、7q-、除t（9；11）以外的11q23異常、inv（3）、t（3；3）、t（6；9）和t（9；22）［6］。本研究中，病例1、2、20均合并有預后良好的異常染色體核型，分別追蹤隨訪35、30、7個月，患者仍呈無病生存狀態(tài)；病例3具有復雜染色體核型表現(xiàn)，患者在確診3個月后出現(xiàn)髓外復發(fā)；病例9染色體核型表現(xiàn)為5q-，確診4個月后出現(xiàn)髓內(nèi)復發(fā)。

正常染色體核型歸為“中等組”，但其對治療的反應以及疾病轉(zhuǎn)歸卻具有高度異質(zhì)性［7-8］。本研究中有12例AML患者具有正常染色體核型，5例初次誘導化學治療不緩解，再次誘導化學治療，其中3例因出現(xiàn)重癥感染、內(nèi)臟出血而死亡，余2例經(jīng)2次誘導化學治療后才獲得完全緩解，但其隨訪時間較短，后續(xù)病情轉(zhuǎn)歸尚需進一步觀察。目前無病生存者9例。這12例AML患者對治療的不同反應及不同的病情轉(zhuǎn)歸，反映染色體核型在評估正常核型患者預后方面的局限性。

SNPa是基于全基因組水平掃描的一種技術，SNPa除可檢測基因組拷貝數(shù)的變化之外，還能夠檢測到LOH和DNA倍數(shù)改變。這些改變也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制之一。本研究23例AML患者中，有19例被檢測到存在SNP，且12例具有正常染色體核型的患者中有11例被檢測到存在SNP。具有正常染色體核型的病例4、11、12、15、17初次誘導不緩解，用傳統(tǒng)評估預后差的指標如高齡、初診時高白細胞、具有復雜染色體核型或合并有NCCN歸類為預后差的染色體核型等，這幾例患者并不符合，究其初次誘導不緩解的原因，可能與其合并17號或21號染色體長臂特定位點發(fā)生SNP有關，其中病例4、11、17患者還存在染色體LOH。

綜上所述，SNPa在染色體核型分析不能提供信息或不能揭示異常時可提供某些有價值線索［9］。然而其提供的某些線索也可能與疾病的診斷和預后并不相關，因此，在白血病的預后評估方面，其應被視為補充手段，而不應認為可以完全取代經(jīng)典的染色體核型分析技術。

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Clinical analysis of chromosome karyotype and single nucleotide polymorphism array in prognostic evaluation of acute myeloid leukemia

Dai Qiangsheng，Chen Zhiyong，Zhang Bo，Long Jianting，Li Heping.Department of Oncology，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China

ObjectiveTo analyze G-banding karyotyping and single nucleotide polymorphism array （SNPa）method in evaluation of prognosis of acute myeloid leukemia（AML），especially for those with normal chromosome karyotype.MethodsG-banding karyotyping and SNPa analysis of the bone marrow from 23 AML patients were performed to detect the chromosome karyotype and SNP status.Clinical prognosis of those patients was observed and the relationship between clinical prognosis and alterations in chromosome genetic information was evaluated.ResultsAmong 23 AML patients detected by G-banding karyotyping，11 were accompanied with abnormal chromosome karyotype and 12 were normal.At the same time，SNPa analysis revealed that 19 patients showed abnormal genetic information and four were normal.Eleven of the twelve patients with normal chromosome karyotype were accompanied by SNP，four of whom presented with loss of heterozygosity（LOH）. Among 12 patients with normal chromosome karyotype，seven gained complete remission after the first chemotherapy induction，and still survived until now.Another two obtained complete remission following the second chemotherapy induction.Three patients failed to obtain complete remission after the first chemotherapy induction and died of severe infection or hemorrhage after the second chemotherapy induction.Among 11 patients with abnormal chromosome karyotype，eight obtained complete remission after the first chemotherapy induction. SNPa indicated that four patients with LOH failed to gain complete remission，probably caused by the occurrence of SNP in the specific sites of long arm of chromosome 17 or 21.Conclusion SNPa can serve as a com-plimentary tool in assessing the prognosis of AML，especially for those with normal chromosome karyotype.

Acute myeloid leukemia；Single nucleotide polymorphism；Karyotyping；Loss of heterozygosity

2015-08-06）

（本文編輯：楊江瑜）

10.3969／j.issn.0253-9802.2015.11.006

廣東省科技計劃基金資助項目（2012B031800032）

510080廣州，中山大學附屬第一醫(yī)院（戴強生，龍健婷，李鶴平）；364000龍巖，福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院（陳志勇）；511400廣州，番禺何賢紀念醫(yī)院（張鉑）

，戴強生，E-mail：daiqs＠163.com